大腸桿菌耐藥株的體外誘導及其acra和mara基因分析-文庫吧
2025-07-20 15:25 本頁面
【正文】 麥康凱培養(yǎng)基接種適量培養(yǎng)物（約105CFU），37oC培養(yǎng)24h，挑選生長良好的菌落，接種于1MIC誘導劑的培養(yǎng)基37oC培養(yǎng)24h，以此類推，逐漸提高培養(yǎng)基中誘導劑的濃度直到誘導前MIC的128倍（據(jù)細菌生長情況誘導劑濃度提高幅度可在1～2倍于原濃度的范圍適當調(diào)整，也可當細菌生長不良時在同一個濃度重復傳代培養(yǎng)）。 耐藥譜的確定上一步最后獲得的誘導劑濃度達到128MIC的耐藥株，作4次無誘導劑傳代培養(yǎng)后，再分別測定三個誘導株對所有受試抗菌藥的MIC，以確定三個誘導株的多重耐藥譜。 受試菌株acrA、marA基因序列的檢測 據(jù)上一步耐藥譜檢測結(jié)果，氯霉素誘導株和環(huán)丙沙星誘導株的耐藥譜相近，而四環(huán)素誘導株的耐藥譜與之差異較大，故選擇四環(huán)素誘導株（名為SEMR）、環(huán)丙沙星誘導株（名為SEICI）和質(zhì)控株（ATCC25922）作acrA、marA基因序列的檢測。 目的基因（acrA、marA）的獲取 DNA提?。喊幢R圣棟等[4]的方法提取SEMR、SEICI和ATCC25922的基因組DNA。 acrA、marA基因的PCR擴增：以大腸桿菌染色體DNA為模板，用引物PACR－F和PACR－R擴增acrA（全長1194bp），用PMAR－F和PMAR－R擴增marA（全長390bp）。%瓊脂糖凝膠進行電泳觀察PCR結(jié)果。 PCR產(chǎn)物的回收：用DNA片段凝膠回收試劑盒回收acrA和marA基因的PCR產(chǎn)物，方法按試劑盒使說明書進行。 acrA、marA基因的克隆 目的基因片段與載體的連接：將回收的PCR產(chǎn)物連接到pGEM－T 載體上。反應體系為：2Rapid Ligation Buffer，5181。l；PCR產(chǎn)物（2ng/181。l），3181。l；pGEM－T vector（50ng/181。l），1181。l；T4 DNA Ligase，1181。l。16℃連接過夜。 感受態(tài)菌的制備：CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細胞[5]。 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：參照《分子克隆指南》[5]進行。 陽性克隆的篩選：利用α互補法（藍/白菌落篩選法）進行陽性克隆的初步篩選[5]。 重組質(zhì)粒的鑒定：堿裂解法[5]提取質(zhì)粒，％瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察并拍照。 重組質(zhì)粒的酶切鑒定：用NcoⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定acrA－pGEM－T和marA－pGEM－T質(zhì)粒。將經(jīng)過電泳篩選出的疑似陽性克隆質(zhì)粒進行NcoⅠ和NotⅠ雙酶切反應，同時做陰性克隆質(zhì)粒的酶切對照。酶切反應體系為：克隆質(zhì)粒，5181。l；10H Buffer，1181。l ；%BSA，2181。l； NcoⅠ，1181。l；NotⅠ1181。l ；ddH2O，10181。l。37℃恒溫水浴2~4h。%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀下觀察電泳結(jié)果并拍照。 重組質(zhì)粒的PCR擴增鑒定：利用PCR反應，對經(jīng)過上述鑒定的疑似陽性質(zhì)粒再作PCR擴增鑒定。用引物PACR－F和PACR－R擴增鑒定acrA－pGEM－T質(zhì)粒；用PMAR－F和PMAR－R擴增鑒定marA－pGEM－T質(zhì)粒。取5181。l %瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果并進行拍照。 重組質(zhì)粒的核苷酸序列測定與分析對經(jīng)上述鑒定后均符合要求的陽性克隆質(zhì)粒進行序列測定（上海博亞生物技術有限公司完成），用DNAsis軟件分析測序結(jié)果。2 結(jié)果 受試藥物的MIC包括三種誘導劑（氯霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星）在內(nèi)的各種受試抗菌藥對于質(zhì)控株的MIC見表1。 誘導株的耐藥性變化四環(huán)素、環(huán)丙沙星和氯霉素三個誘導株的MIC變化詳見表2。從表中可見，在四環(huán)素誘導株，除小諾霉素、妥布霉素、阿米卡星和鏈霉素的MIC沒有明顯的提高外，青霉素鉀、頭孢噻肟、四環(huán)素、土霉素、氯霉素、利福平、甲砜霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和頭孢西丁的MIC提高幅度都有達到或超過4倍（經(jīng)統(tǒng)計處理，MIC變化值≥4MIC為具有顯著性意義）；在環(huán)丙沙星誘導株，只有頭孢噻肟MIC提高倍數(shù)達到或超過了4，而其它受試抗菌藥的MIC變化都沒有顯著性意義；氯霉素誘導株與環(huán)丙沙星誘導株相似，只有頭孢噻肟的MIC提高具有顯著性意義，而其他藥物沒有顯著意義。 acrA、marA基因檢測結(jié)果 SEMR、SEICI和ATCC25922基因組DNA的提取結(jié)果從ATCC2592SEMR、%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察到一條特異帶，大于23kb。見圖1。 SEMR、SEICI、ATCC25922 acrA、marA基因的PCR擴增結(jié)果acrA、marA %瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker DL2,000為對照，結(jié)果在約1194bp和390bp處分別出現(xiàn)特異的目的片段，與預計的片段大小吻合。見圖圖3。表1 受試藥物的MIC （ug/ml） Table 1 MIC of antibacterial agents （ug/ml）抗菌藥 MIC 抗菌藥 MIC 抗菌藥 MICantibacterial agents antibacterial agents antibacterial agents青霉素鉀 Benzylpenicillin K 64
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