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2025-07-20 09:38 本頁面
【正文】 外免疫法 ? 體外免疫法：用于不能采用體內免疫法的情況下，如制備人源性單克隆抗體，或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時使用。 ? 體外免疫法所需要的抗原量少，一般只需幾個 ?g，免疫期短，僅 4~5天，干擾因素少，已成功制備出針對多種抗原的單克隆抗體，但融合后產生的雜交瘤細胞株不夠穩(wěn)定。其基本方法是用 4~8周齡 BALB/c小鼠的脾臟制成單個細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達 ~5 ?g/ml， 在 5%CO37℃ 下培養(yǎng) 4~5天，再分離脾臟細胞，進行細胞融合。 二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 1）細胞融合基本方法：取適量脾細胞（ 1 108）與骨髓瘤細胞（ 2 107 ~3 107）進行混合，在聚乙二醇（ PEG） 作用下誘導它們融合，時間控制在 2min以內，然后用培養(yǎng)液將 PEG融合液緩慢稀釋。 ? （ 2）用于融合的骨髓瘤細胞應具備條件：融合率高，自身不分泌抗體，所產生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定等特點。書中表 41列舉了主要的骨髓瘤細胞系，其中 SP2/0、 ，細胞融合后產生的雜交瘤細胞只分泌均一的、完全來自脾細胞的抗體分子，它們是目前較為理想的可供融合的骨髓瘤細胞。特別是 SP2/0細胞系還具有容易培養(yǎng)、融合率高等特點，被國內外多個實驗室廣泛采用。 二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 3）誘導劑 PEG的影響： PEG分子量以及濃度越大，促融率越高。但其粘度和對細胞的毒性也隨之增大。目前常用的 PEG的濃度為 40%~50%，相對分子質量以 4000為佳。但相對分子量400~6000，濃度在 10%~50%范圍之間的 PEG都能使細胞融合。為了提高融合率，在 PEG溶液中加入二甲基亞砜 (DMSO）， 以提高細胞接觸的緊密性，增加融合率。但是， PEG和 DMSO都對細胞有毒性，必須嚴格限制它們和細胞的接觸時間，可通過低速離心 5min使細胞接觸更為緊密，然后用新配制的培養(yǎng)液來稀釋藥物并洗滌細胞。 二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 4）培養(yǎng)基的正確選擇：常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是次黃嘌呤（ H）、 氨基喋呤（ A） 和胸腺嘧啶（ T） 配制的。其中氨基喋呤（ A） 能阻斷 DNA合成的主要途徑，瘤 瘤融合細胞和瘤細胞因不能合成 DNA而死亡。脾 脾融合細胞和瘤細胞在這樣的條件下，幾天內亦迅速死亡。由于 SP2/0等骨髓瘤細胞都是次黃嘌呤（ H） 鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 (HGPRT） 缺乏株，脾細胞中卻有這種酶，因此脾 瘤融合的雜交瘤細胞可利用 HGPRT酶，用次黃嘌呤（ H） 和胸腺嘧啶（ T） 合成 DNA， 使雜交瘤細胞得以生長 二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 5）選擇性培養(yǎng)方法：通常將融合的細胞懸浮于 HAT的培養(yǎng)液（配方見書中表 42），加入到含有飼養(yǎng)細胞的 96孔板內，根據(jù)情況每 2~3天換液一次。換液時吸去 1/2~2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液。在融合后 7天內用 HAT培養(yǎng)液，殺死瘤 瘤融合細胞后，第 7~14天改用 HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的 RPMI1640 完全培養(yǎng)液（配方書中表 43），從融合后 8~9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進行抗體檢測，篩選出產生抗體的陽性克隆。 二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 6）飼養(yǎng)細胞： ? 由于在最適的條件下大約有 105個脾細胞才能形成一個雜交瘤細胞，大量瘤細胞在 HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個或少數(shù)的雜交瘤細胞多半不能存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖。 ? 常用的飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞和胸腺細胞等。一般認為飼養(yǎng)細胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。小鼠腹腔巨噬細胞還能清除死亡細胞，故應用的較多。 三、篩選陽性克隆與克隆化 ? （ 1）篩選陽性克?。? ? 因為產生特定抗原的抗體產生細胞只占所有脾細胞的5%左右，所以要進行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作，以選擇出陽性克隆，然后進行克隆化培養(yǎng)。 ? 為了盡快地篩選出陽性克隆，必須采用微量、快速、特異、敏感、簡便并一次能檢測大批標本的方法。常用的檢測方法有免疫酶技術、免疫熒光技術和放射免疫技術等。一般來說，免疫酶技術和放射免疫技術均適用于可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測。免疫熒光技術適用于細胞抗原的抗體檢測，特別是制備以檢測患者活檢組織標本為目的的抗體時，免疫熒光法更有意義，在篩選抗體的同時，還能對所識別的抗原進行定位判定。 精制破傷風毒素抗原（ ）吸附 （約 10?g/ml， 4℃ ， 3h） 洗滌 加雜交瘤培養(yǎng)上清液（ ） （ 4℃ ， 1h） 加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體（ ） （ 4℃ ， 1h）
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