鈉鈣交換體基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及藥物篩選細胞模型的建立-文庫吧
2025-06-30 22:32 本頁面
【正文】 CX可以通過正向轉(zhuǎn)運（Ca2+ 外流）或者反向轉(zhuǎn)運（Ca2+ 內(nèi)流）兩種轉(zhuǎn)運方式將Na+ 和Ca2+以3：1或者4：1的比例進行交換，從而維持細胞內(nèi)Ca2+ 的穩(wěn)定[13]。生理狀態(tài)下，NCX主要利用細胞內(nèi)外的Na+ 濃度梯度排出細胞中的Ca2+[4]，而在病理狀態(tài)下，當細胞內(nèi)Na+ 濃度升高時，NCX反向轉(zhuǎn)運可以導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載。近年來越來越多的研究表明NCX與腦缺血關(guān)系非常密切，但結(jié)論并不一致。有的研究者認為抑制NCX反向轉(zhuǎn)運具有腦保護作用，而有的研究者卻認為激活NCX的反向轉(zhuǎn)運可以有效保護神經(jīng)元[5]。此外，在低氧缺氧，脊髓損傷后的白質(zhì)退行性病變，大腦損傷，視神經(jīng)損傷，神經(jīng)元調(diào)亡，衰老和阿爾茲海默病等相關(guān)疾病中，也有研究提示NCX可能發(fā)揮了重要的作用[6]。由于NCX具有重要的生理和病理學(xué)意義，自1968年Baker等人首次報道NCX的存在以來，一直是人們研究的熱點。內(nèi)容包括NCX的分布表達，活性調(diào)節(jié)，結(jié)構(gòu)功能關(guān)系以及在疾病過程中的作用等方面，研究手段包括RNA/蛋白水平定位，反義寡核苷酸/RNAi技術(shù)，制備基因敲除小鼠等。但研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義寡核苷酸技術(shù)僅在體外可行，體內(nèi)無效[79]，NCX1基因敲除小鼠在胚胎狀態(tài)則已死亡[10]。因此，在這種情況下，急需研發(fā)一種選擇性的NCX抑制劑以便觀察NCX的作用。比較遺憾的是，至今為止還沒有找到具有高特異性的化合物，也沒有以NCX為靶點的臨床藥物上市。哺乳動物細胞中共有三種NCX亞型，NCX 1在體內(nèi)廣泛存在，主要位于腦，心臟，腎臟等部位，在上述組織中，已檢測到7種NCX1剪切產(chǎn)物，其中，，其余三種剪切產(chǎn)物。NCX2和NCX3僅在腦和骨骼肌中有表達，其中NCX3有3種剪切產(chǎn)物，而至今未檢測到NCX2的選擇性剪切產(chǎn)物[6]。此外，各種NCX亞型具有不同的分布特性，這提示不同的NCX亞型在腦缺血中的作用可能不同。同時，NCX還具有雙向轉(zhuǎn)運特性，這也增加了以NCX為靶點進行藥物開發(fā)的難度。因此，在篩選以NCX為靶點的化合物時，必需觀察化合物對不同的選擇性剪切產(chǎn)物及其轉(zhuǎn)運方式的影響?；谏鲜鲈?，，，，并觀察了溫度與NCX抑制劑KBR7943對INCX的影響，希望通過該細胞膜型篩選化合物以便開發(fā)新型的NCX調(diào)節(jié)劑。 AB結(jié)果 Fig1. Structures of + and +/NCX plasmids. (A) Structure of blank + plasmid. (B) Structure of +/NCX plasmids after double digestion and subsequent insertion of NCX genes to Hind Ⅲ and BamH Ⅰ site.圖1. ++/NCX質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。(A)+質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，(B)+/NCX質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切，再插入三種不同的NCX目的基因。質(zhì)粒鑒定結(jié)果：12345215000bp210000bp27500bp25000bp22500bp21000bp（1）酶切：+質(zhì)粒， I和Hind Ⅲ分別進行酶切，酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳進行初步鑒定。Fig2. Analysis of BamH Ⅰ and Hind Ⅲ treated + plasmid on 1% ethidium bromidestained agarose gel. Line 1: single digestion product of + vector by Hind Ⅲ。 Line 2: single digestion product of + vector by BamH Ⅰ。 Line 3: double digestion product of + vector by BamH Ⅰand Hind Ⅲ。 Line 4: untreated + vector。 Line 5: Marker。圖2. 應(yīng)用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ+載體進行分析鑒定。條帶1： Hind Ⅲ單酶切；條帶2： BamH Ⅰ單酶切；條帶3： BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切；條帶
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