【正文】 合哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的真核載體。材料與方法一、 實(shí)驗(yàn)材料（一） HSV病毒株序列來源HSV I gB基因序列來源于GenBank中的Patton株登錄號為K03541（二） 生物信息學(xué)分析軟件Anthewin 軟件：能分析、預(yù)測蛋白質(zhì)的各種特性，繪制蛋白序列的所有理化特性曲線。OptimumGeneTM軟件：專業(yè)的基因優(yōu)化軟件。（三） 菌株與質(zhì)粒載體大腸桿菌Escherichia coli DH5α、真核表達(dá)載體pMCE5由本實(shí)驗(yàn)室保存。（四） 主要試劑與儀器設(shè)備PrimeSTAR HS（Premix）DNA Polymerase、EcoR I、 Not I、T4 DNA連接酶、核酸分子量marker（DL 2000；250 bp ladder）、質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit ）、PCR產(chǎn)物純化試劑盒（TaKaRa DNA Fragment Purification Kit ）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit ）為TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品；其它常用試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純以上級產(chǎn)品。TC–512型PCR擴(kuò)增儀(英國Techne公司)；DDY–5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；TM2000型凝膠成像分析儀(美國Alpha Innotech公司)；CS–15R型臺式低溫高速離心機(jī)（美國Beckman公司）； CO2恒溫培養(yǎng)箱為產(chǎn)品（Heraeus公司）；HH–W21–600S型數(shù)顯電熱恒溫水溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；THZ–C型恒溫培養(yǎng)搖床（江蘇太倉實(shí)驗(yàn)儀器廠）；BS210S型電子分析天平（美國Sartorius公司）；超純水儀（美國MillionQ公司）。二、 實(shí)驗(yàn)方法（一） 蛋白抗原性分析應(yīng)用Anthewin 分析軟件分析GenBank中HSV I 型Patton株gB蛋白的氨基酸序列（K03541），針對氨基酸的抗原性、親水性、疏水性和表面可及性等多個參數(shù)，對HSV I gB氨基酸序列進(jìn)行抗原表位的系統(tǒng)分析。（二） 化學(xué)合成基因的設(shè)計原則為達(dá)到融合蛋白的高水平表達(dá)，優(yōu)化基因序列，重新設(shè)計合成目的基因。參考OptimumGeneTM軟件分析數(shù)據(jù)，采用最佳密碼子，去除去穩(wěn)定序列，減少了AT和GC重復(fù)，使mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并且提高了目的基因中G+C的含量，消除富含AT的序列區(qū)段，避免翻譯的提前終止等。（三）真核表達(dá)載體構(gòu)建[51]載體質(zhì)粒DNA的提取與純化采用TaKaRa公司質(zhì)粒抽提試劑盒 (TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit ) 進(jìn)行小量制備，具體步驟如下：（1）取過夜培養(yǎng)的菌液（含質(zhì)粒載體，100 181。g/mL Ampr選擇性LB培養(yǎng)液）3 mL，于12000 rpm離心2 min，棄上清。（2）用250 181。L Solution I（用前加RNase A, 4℃保存）重懸沉淀，混勻。（3）加入250 181。L Solution II，輕輕顛倒試管混勻4–6次，使菌體充分裂解，形成透明液（此步驟時間須小于5 min）。（4）加入400 181。L預(yù)冷的Solution III，輕輕顛倒試管混勻4–6次，有沉淀生成，室溫靜置2 min。（5）室溫12000 rpm離心10 min，取上清（此時4℃離心不利于沉淀降解）。（6）將試劑盒中的Spin Column 安置于Collection Tube 上。（7）將上述操作5的中溶液移至Spin Column中，12000 rpm離心1 min，棄濾液。（8）將500 181。L的 Rinse A 加入Spin Column中，12000 rpm離心30 s，棄濾液。（9）將700 181。L 的Rinse B 加入Spin Column中，12000 rpm離心30 s，棄濾液。（10）重復(fù)操作步驟9。（11）將Spin mL離心管上，在Spin Column膜的中央處加入50 181。L的滅菌水或Elution Buffer，室溫靜置1 min。（把滅菌水或Elution Buffer加熱至60℃使用時有利于提高洗脫效率。）（12）12000 rpm離心1 min洗脫DNA。（13）取1~2 %瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，其余置－20℃保存?zhèn)溆?。目的基因與質(zhì)粒載體的雙酶切選擇兩個在目的基因和質(zhì)粒載體上均為單一切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶EcoR I、 Not I分別對目的基因、質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生兩個不同的粘性末端。酶切反應(yīng)在80 181。L反應(yīng)體系進(jìn)行，并選用兩種酶切割效率都較高的緩沖液。反應(yīng)成分用量ddH2O 181。LBSA 10H Buffer 181。LDNA（HSV I gB/ pMCE5） 181。LEcoR I 181。LNot I 181。L體系合計 181。L混勻后在37℃（水浴或溫箱）反應(yīng)3 h后取出，采用TaKaRa公司的DNA膠回收試劑盒（TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit ）%瓊脂糖凝膠中回收酶切后的目的基因和質(zhì)粒載體DNA片段。具體步驟如下：（1）使用TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，對目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（2）在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體。此時應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。（切膠時注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。）（3）切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時間，提高DNA的回收率。（4）稱量膠塊重量，計算膠塊體積。計算膠塊體積時，以1 mg=1 181。L 進(jìn)行計算。（5）向膠塊中加入膠塊融化液DR–I Buffer，DR–I Buffer的加量如下表：凝膠濃度DR–I Buffer使用量%3個凝膠體積量%~%4個凝膠體積量%~%5個凝膠體積量（6）均勻混合后75℃加熱融化膠塊（低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠只需在45℃加熱）。此時應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6~10 min，膠塊一定要充分融化，否則將嚴(yán)重影響DNA的回收率。）（7）向上述膠塊融化液中加入DR– I Buffer量的1/2體積量的DR–II Buffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400 bp 的DNA片斷時，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。（8）將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。（9）將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000 rpm離心1 min，棄濾液。（如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA的回收率。）（10）將500 181。L Rinse A 加入Spin Column，12000 rpm離心30 s，棄濾液。（11）將700 181。L Rinse B 加入Spin Column，12000 rpm離心30 s，棄濾液。（12）重復(fù)操作步驟11。（13）將Spin mL離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25 181。L的滅菌水或Elution Buffer，室溫靜置1 min。（把滅菌水或Elution Buffer加熱至60℃使用時有利于提高洗脫效率。）（14）12000 rpm離心1 min洗脫DNA，收集于－20℃保存?zhèn)溆?。目的基因與質(zhì)粒載體的連接連接反應(yīng)體系中插入DNA與載體DNA的加入量關(guān)系為：反應(yīng)成分用量10T4 DNA Ligase Buffer 181。LpMCE5 DNA (EcoR I + Not I) 181。L HSV I gB DNA (EcoR I + Not I) 181。LT4 DNA Ligase 181。L體系合計 上述混合液分別混勻后于16℃連接過夜。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（1）、E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）：①從37℃培養(yǎng)16~20 h的新鮮LB平板上挑取一個單菌落接種到含有3 mL LB培養(yǎng)液的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。②取過夜培養(yǎng)物按1：50稀釋比例接種至50 mL新鮮的LB培養(yǎng)液中，于37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2~3 h。~，將菌液置冰上冷卻后，于4℃以4000 rpm離心10 min沉淀細(xì)菌。③棄上清并用10 mol/L氯化鈣溶液重懸沉淀，冰浴10 min，離心同上，回收菌體。④棄上清，每50 mL初始培養(yǎng)物用2 mol/L氯化鈣溶液重懸細(xì)菌沉淀，冰浴30 min或過夜即可使用。（2）、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：① mL eppendorf管中加入200 181。L DH5α感受態(tài)細(xì)菌懸液和10181。L上述連接反應(yīng)液，輕輕混勻后冰浴40 min。②取出eppendorf管于42℃熱休克90 s后快速將此管轉(zhuǎn)移至冰浴中，使細(xì)胞冷卻2 min。③加入1 mL預(yù)溫的LB培養(yǎng)液，混勻后于37℃，100 rpm搖床培養(yǎng)1h。④轉(zhuǎn)化液混勻后取200 181。L涂布在新鮮的Ampr（100 181。g/mL）選擇性LB培養(yǎng)基平板上，置37℃溫箱培養(yǎng)過夜。（轉(zhuǎn)化反應(yīng)中同時設(shè)一空白宿主菌作為對照板，若此平板中無菌落生長則說明無污染）重組質(zhì)粒的鑒定[52]（1）、引物的設(shè)計與合成根據(jù)合成的全新HSV I gB基因片段設(shè)計一對引物，以引物設(shè)計常見原則如：引物長度一般在15~30堿基之間；引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃；引物3162。端避開密碼子的第3位；避免形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，設(shè)計引物如下：HSV I gB（1538bp，EcoR I + Not I）上游引物P1：GCAAGCTTGCCGCCACCATGGAA下游引物P2：GCGGATCCTTAGCTAGAGGTAGT（2）、重組質(zhì)粒的PCR鑒定：①于上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)平板上挑取若干個單菌落分別接種于3 mL含Ampr（100 181。g/ml）的LB培養(yǎng)液中，同時接種一管含有空質(zhì)粒載體的宿主菌作為陰性對照，一起于37℃振蕩培養(yǎng)。②各取1 mL上述菌液離心收菌，用50 181。L ddH2O重懸菌體沉淀，沸水浴5 min后置冰上。③于4℃以12000 rpm離心5 min，上清即為PCR鑒定用模板。④分別取上述模板3 181。L，以PP2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，每管反應(yīng)體系20181。L，PCR反應(yīng)條件如下：反應(yīng)成分用量PrimeSTAR HS（Premix） 181。LP1（上游引物，10 pmol/181。L） 181。LP2（下游引物，10 pmol/181。L） 181。LDNA（模板） 181。LddH2O 181。L體系合計 181。L上述試劑加入PCR反應(yīng)管中混勻后稍離心，上層加50181。L滅菌石蠟油后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4 min；再94℃ 30 s，55℃ 30s，72℃ 1 min/kbp，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。⑤分別取上述PCR產(chǎn)物2181。L，%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）電泳鑒定（80 V，40 min），凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。（3）、重組質(zhì)粒的酶切鑒定：①將PCR鑒定的陽性克隆菌培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定目的基因片段是否插入載體酶切位點(diǎn)之間。反應(yīng)成分用量ddH2O 181。LBSA 10H Buffer 181。L重組DNA 181。LEcoR I 181。LNot I 181。L體系合計 181。L混勻后在37℃（水浴或溫箱）反應(yīng)3 h后取出。②%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）電泳鑒定（80 V，40 min），凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。（4）、重組質(zhì)粒的DNA測序鑒定：將PCR鑒定的陽性克隆菌培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，用PCR擴(kuò)增用特異性引物對（PP2）進(jìn)行DNA序列測定，以確定目的基因片段插入載體后其閱讀框架是否正確。結(jié)果一、 HSV I gB 抗原表位分析：（一） HSV I gB 氨基酸序列（下劃線為胞外區(qū)序列）：MRQGAPARGCRWFVVWALLGLTLGVLVASAAPSSPGTPGVAAATQAANGGPATPAPPALGAAPTGDPKPKKNKKPKNPTPPRPAGDNATVAAGHATLREHLRDIKAENTDANFYVCPPPTGATVVQFEQPRRCPTRPEGQNYTEGIAVVFKENIAPYKFKATMYYKDVTVSQVWFGHRYSQFMGIFEDRAPVPFEEVIDKINAKGVCRSTAKYVRNNLETTAFHRDDHETDMELKPANAATRTSRGWHTTDLKYNPSRVEAFHRYGTTVNCIVEEVDARSVYPYDEFVLATGDFVYMSPFYGYREGSHTEHTSYAADRFKQVDGFYARDLTTKARATAPTTRNLLTTPKFTVAWDWVPKRPSVCTMTKWQEVDEMLRSEYGGSFRFSSDAISTTFTTNLTEYPLSRVDLGDCIGKDARDAMDRIFARRYNATHIKVGQPQYYLANGGFLIAYQPLLSNTLAELYVREHLREQSRK