大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與蛋白表達(dá)純化-文庫吧
2025-06-15 19:38 本頁面
【正文】 可溶性。降低表達(dá)速度，可采取低溫誘導(dǎo)，如15℃誘導(dǎo)過夜，或者采用弱啟動子表達(dá)載體。嘗試一些特殊設(shè)計的表達(dá)宿主Origami：thioredoxin redμctase/glμtathione redμctase 雙突變適合帶thioredoxin redμctase的融合表達(dá)載體，幫助形成更多的二硫鍵。對于一些蛋白可能無法實現(xiàn)可溶性表達(dá)，這時候溶解包涵體后再純化是唯一的解決辦法。（SDSPAGE）大腸桿菌表達(dá)純化外源蛋白，SDSPAGE是必不可少的操作?？梢杂脕頇z測蛋白的表達(dá)情況(表達(dá)量，表達(dá)分布等)，用來分析純化的目的蛋白的純度。本小節(jié)列出SDSPAGE 操作中一些試劑的配置及其基本的操作過程。（1）30%丙烯酰胺貯存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’亞甲雙丙烯酰胺溶于100ml熱水中。置棕色瓶中，4℃保存。丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。建議實驗室劃出專門的臺面，設(shè)置單獨(dú)的配置器皿進(jìn)行SDSPAGE 的相關(guān)實驗。（2）（）溶液。（3）10% SDS溶液：SDS 加入ddH2O ToTo100。（4）10%過硫酸銨：新鮮配制。（5）TEMED溶液：4℃保存。（6） mol/L Tris（）溶液。（7）2樣品溶解液：2%SDS，5%巰基乙醇，10%甘油，%溴酚藍(lán)，（）緩沖液。（8）5Tris甘氨酸電極緩沖液： Tris，94g甘氨酸和5g SDS定容到1000ml（建議每次電泳用新稀釋的緩沖液）。（9）考馬斯亮藍(lán)R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2）中，攪拌溶解。（10）脫色液：10%冰醋酸（可加如乙醇，建議不要使用甲醇）。凝膠制備（1）安裝洗滌干凈的玻璃板、板條，并將玻璃板固定在電泳槽中。（2）配制10%的分離膠（具體參考表2）：迅速在兩玻璃板間隙中灌注分離膠，直至剩余的板寬比梳子長度多1cm。小心在膠上覆蓋一薄層異丙醇或水。（3）在分離膠聚合的過程（可置于37℃，約10min）中，配制5%的積層膠（參考表格3）。（4）分離膠聚合完全后，倒去異丙醇或水，用濾紙吸干膠面上的殘余。（5）灌注積層膠，立即插入干凈的梳子，避免產(chǎn)生氣泡。（6）積層膠聚合完全后，小心拔出梳子，撥去封膠用的塑料條，固定于電泳槽。（7）在上下電泳槽中加入足夠的電泳緩沖液。樣品的制備在蛋白溶液中加入等體積的2樣品溶解液，混合液在沸水浴中加熱5min，冷卻后即可上樣。上樣用微量移液器上樣，每加入一種樣品，上樣量根據(jù)根據(jù)具體的樣品濃度確定，未知濃度一般用10微升。電泳對于一塊膠，在濃縮膠中電流設(shè)置在15～20mA,當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后可設(shè)置電壓至電流約為25～30mA，繼續(xù)電泳直至染料到達(dá)離凝膠底部1cm處。后處理（1）染色：加入染色液（用量同上），室溫染色30min～1h。Tip：染色前可將染色液在微波爐里加熱至沸，然后搖床震蕩染色約10min即可。（2）脫色：將染色后的膠塊用水洗滌三次去除表面染料，然后加入脫色液脫色，其間更換脫色液3～4次至條帶清晰。Tip：10min快速脫色:將脫色液置于微波爐煮沸，更換三次脫色液。表2. 配制SDSPAGE 不同濃度分離膠的配置不同體積（ml）凝膠液中各成分所需體積（ml）Gel%組成所需要各成份體積（ml）510152025306%水30%丙烯酰胺溶液123456()510%SDS10%過硫酸氨TEMED8%水30%丙烯酰胺溶液48()510%SDS10%過硫酸氨TEMED10%水430%丙烯酰胺溶液510()510%SDS10%過硫酸氨TEMED12%水30%丙烯酰胺溶液24681012()510%SDS10%過硫酸氨TEMED15%水30%丙烯酰胺溶液51015()510%SDS10%過硫酸氨TEMED 5%濃縮膠的配置Gel%組成所需要各成份體積（ml）1234565%水30%丙烯酰胺溶液()10%SDS10%過硫酸氨TEMED大腸桿菌細(xì)胞破碎有很多方法，譬如反復(fù)凍融法，滲透沖擊，超聲破碎，壓力破碎等。其中超聲破碎和壓力破碎破碎是我室常用方法。在建立表達(dá)條件過程中，小量制備樣品可用小型超聲細(xì)胞粉碎儀?！?誘導(dǎo)后的菌液收集菌體，然后視菌體的量加入300～500μl的緩沖液重懸細(xì)胞，然后置于冰上超聲破碎。因很多實驗室有自己的小型超聲粉碎器,各個操作不盡相同，具體操作參考儀器說明書。常規(guī)操作步驟如下（以100ml 培養(yǎng)液為例）：（1）100 ml 誘導(dǎo)后的菌液（OD600= 左右），12000 rpm，4℃離心2min，收集菌體。（2）加入預(yù)冷的緩沖液50ml，重懸細(xì)胞洗滌菌體一次，12000 rpm，4℃離心2min，收集菌體；常規(guī)的操作所使用的緩沖液多為PBS 或者 TrisNaCl，針對不同的載體和純化方法，選擇相應(yīng)的緩沖液。對于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整個操作過程中加入一些蛋白酶抑制劑。（3）向沉淀中加入15ml的緩沖液同上（若菌體太濃，可加倍），充分懸浮，將菌懸液裝在一個玻璃小燒杯中，置于冰水混合物中。（4）破碎：將用緩沖液洗滌過的超聲探頭伸入到菌液中，不要接觸燒杯底部，每處理30sec間隔1min使菌液冷卻，輸出強(qiáng)度為5～6，頻率為60～70％。（5）分離上清和沉淀：12000 rpm，4℃離心20min，分離上清和沉淀。（6）SDSPAGE 分析蛋白表達(dá)情況。（7）準(zhǔn)備純化蛋白。超聲破碎注意事項與一些小的改進(jìn)：（1）破碎完全的判斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲完全后變的透明、清澈。（2）如果超聲時出現(xiàn)黑色沉淀，說明超聲功率太強(qiáng)。（3）超聲時間太長、功率太高對蛋白活性肯定有影響。（4）盡量防止泡沫的產(chǎn)生。（5）大量破碎時將菌液置于一玻璃器皿中，破碎時放在冰水混合物中，以增加散熱，減小對蛋白的破壞作用。（6）破碎前的預(yù)處理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）處理破環(huán)細(xì)胞壁（10min，30℃），增加細(xì)胞的通透性。高壓破碎是大量的破碎提取細(xì)胞內(nèi)成份的首先方法，相對于超聲破碎，它具有過程溫和，操作迅速等優(yōu)點(diǎn)，具體使用需要根據(jù)具體的儀器使用說明。FRENCH174。 PRESS 細(xì)胞破碎儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（1）使用前將高壓腔、底座、活塞桿在4℃冰箱中預(yù)冷30min。（2）將三腳固定器置于水平桌面上，將高壓腔正放在固定器器上；在活塞桿的O型環(huán)、底座的O型環(huán)和針形閥的O型環(huán)上均勻涂上少量凡士林。（3）把活塞桿正向插入高壓腔至最大加樣線，將整個腔體連同活塞桿一起倒轉(zhuǎn)固定在固定器上。（4）將菌液倒入腔體，最大處理量為35ml，最小為5ml。視樣品體積，大致估計并調(diào)整活塞桿的位置。（5）將針形閥和樣品噴射管裝配于底座上，針形閥擰到輕輕不能擰動為止，并向反方向稍微松動，保證閥門處于開啟狀態(tài)（注意：務(wù)必不能
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