【正文】 Bradford法適合于大規(guī)模測(cè)定樣品，但是樣品中不能含有太高濃度的去污劑，對(duì)樣品的要求較高。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種。（2）冷凍干燥濃縮法這是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的辦法，它既使蛋白質(zhì)不易變性，又保持蛋白質(zhì)中固有的成分。收集3～5管樣品洗脫液，收集體積為1 ml/每管。通過(guò)“tac”強(qiáng)啟動(dòng)子和malE翻譯起始信號(hào)使克隆基因獲得高效表達(dá)，并進(jìn)一步利用MBP對(duì)麥芽糖的親和性達(dá)到用Amylose柱對(duì)融合蛋白的一步親和純化?！ㄈ?X GST Bind/Wash buffer，PBS）的平衡細(xì)胞裂解前加入DTT會(huì)顯著改善某些GST融合蛋白與GSTBind樹(shù)脂的結(jié)合GST融合蛋白被超聲打斷降解：過(guò)度超聲會(huì)破壞帶標(biāo)簽的蛋白而減少其與樹(shù)脂的結(jié)合。（5）向沉淀中加入約40ml 的PBS，輕柔混勻，振蕩溫育10 min，2000 rpm，離心5min，小心傾倒出上清。（12） EDTA 。策略：在超聲破碎細(xì)胞之前加入去垢劑或者還原劑；增加去垢劑的濃度，（2 % Triton X100 or 2 % Tween 20）；或者在wash buffer中增加甘油的濃度（50%）減少非特異性的相互反應(yīng)；考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子可能原因4：洗滌不充分。策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH來(lái)找出最佳的洗脫條件。（2）上樣：。SDSPAGE 分析蛋白的表達(dá)情況。純化蛋白的原理是：當(dāng)親和層析柱負(fù)載了Ni2+后，可以選擇性吸附暴露在蛋白表面具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基（特別是組氨酸殘基）。（2）各O形環(huán)處（包括樣高壓腔，底座，活塞桿和針形閥）一定要涂凡士林潤(rùn)滑，以降低磨損，防止損傷。將菌液倒入腔體，最大處理量為35ml，最小為5ml。（5）分離上清和沉淀：12000 rpm，4℃離心20min，分離上清和沉淀。后處理（1）染色：加入染色液（用量同上），室溫染色30min～1h。（7）2樣品溶解液：2%SDS，5%巰基乙醇，10%甘油，%溴酚藍(lán)，（）緩沖液。嘗試一些特殊設(shè)計(jì)的表達(dá)宿主Origami：thioredoxin redμctase/glμtathione redμctase 雙突變適合帶thioredoxin redμctase的融合表達(dá)載體，幫助形成更多的二硫鍵。M15/SG13009：自身表達(dá)T5 RNA polymerase，主要用于pQE系列載體的表達(dá)。適用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作為啟動(dòng)子的載體。融合表達(dá)是在目標(biāo)蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促進(jìn)蛋白的正確折疊，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的快速親和純化，或者實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)定位。目前常使用的表達(dá)載體主要是由Novagen 提供的pET 系列和 Qiagen 公司提供的pQE 系列。擁有trxB和gor突變的菌株比單具，trxB突變的菌株更有可能促進(jìn)二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。很多外源基因在大腸桿菌表達(dá)時(shí)很容易形成不可容的包涵體，其原因可能有：表達(dá)量過(guò)高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體；蛋白合成速度太快，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確配對(duì)；過(guò)多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度等。（1）30%丙烯酰胺貯存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’亞甲雙丙烯酰胺溶于100ml熱水中。（2）配制10%的分離膠（具體參考表2）：迅速在兩玻璃板間隙中灌注分離膠，直至剩余的板寬比梳子長(zhǎng)度多1cm。 5%濃縮膠的配置Gel%組成所需要各成份體積（ml）1234565%水30%丙烯酰胺溶液()10%SDS10%過(guò)硫酸氨TEMED（3）超聲時(shí)間太長(zhǎng)、功率太高對(duì)蛋白活性肯定有影響。將固定夾固定于支持桿上，擰緊固定夾上的兩個(gè)螺絲以固定腔體。（6）嚴(yán)禁使活塞桿下至安全線以下，否則會(huì)導(dǎo)致活塞桿與底座損壞。 重組蛋白的誘導(dǎo)（1）載體構(gòu)建：本實(shí)驗(yàn)采用pET28a（+）表達(dá)載體， DH5α， BL21(DE3)。（4）開(kāi)始用5倍柱床體積的含20 mM咪唑的starting buffer進(jìn)行洗脫，并對(duì)洗脫液進(jìn)行收集。（6）選擇合適的純化蛋白樣品，加入1倍體積的預(yù)冷甘油。試用去污劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件(去折疊)下洗脫(用4～8 M脲，或4～6 M 鹽酸胍)。NTA再生步驟：（1）從層析柱下端流干所有溶液， Acetic Acid/6M gμanidine HCl 洗。GST 融合于目標(biāo)蛋白的N端，可以通過(guò)谷胱甘肽瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。方法二：是純化不含GSTtag 的蛋白，按照說(shuō)明書(shū)將蛋白酶PreScission Protease（GE公司）用PBS 稀釋到到1ml，加入到（6）中的樹(shù)脂中，輕輕混勻然后4℃溫育12h，收集流出液，即為GFP的純化產(chǎn)物。每次在臨純化前新鮮配制1X洗脫緩沖液洗脫緩沖液中谷胱甘肽濃度太低：GST?Bind樹(shù)脂的還原型谷胱甘肽濃度達(dá)到10mM就夠了。所有這些載體都含有一段編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，融合蛋白純化后，通過(guò)Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。 Amylose樹(shù)脂可以采用下述清洗步驟進(jìn)行再生水3倍柱床體積% SDS3倍柱床體積水1倍柱床體積過(guò)柱緩沖液3倍柱床體積【注意事項(xiàng)】（1）每次使用時(shí)，請(qǐng)先打開(kāi)頂端的帽子再移去底部的帽子，以避免氣泡進(jìn)入到預(yù)裝柱內(nèi)。干燥后的蛋白質(zhì)保存方便，應(yīng)用時(shí)可配成任意濃度使用。首先，對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差，故該法適于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。蛋白溶液的保存原則：（1）緩沖液pH 避免接近蛋白的等電點(diǎn)；（2）根據(jù)每次使用的量分裝成多管，這樣可避免反復(fù)凍融；（3）加入穩(wěn)定劑如甘油，DTT, TritonX100等。該法測(cè)定要求樣品中不能有能與考馬斯亮藍(lán)G250反應(yīng)顯色的去污劑，比如Triton、NP400、吐溫等。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。（4）可在細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)中表達(dá)（pMALp2X載體）：周質(zhì)表達(dá)可提高二硫鍵的形成，促進(jìn)蛋白折疊的形成。添加劑：1 mM sodiμm azide；10 mM β－mercaptoethanol 或1 mM DTT。操作過(guò)程中目標(biāo)蛋白降解：控制操作條件，比如嚴(yán)格4℃操作，緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，超聲處理過(guò)度：減少超聲，避免發(fā)泡導(dǎo)致蛋白變性。其它可以選用做去除污染蛋白的緩沖液還包括：6M尿素，6M鹽酸胍或低極性溶劑，如50～70%乙醇或50%乙二醇。蛋白的誘導(dǎo)與樣品的制備方法基本同上。（7）用5倍體積的100%乙醇洗。策略1：咪唑濃度必須優(yōu)化，以確保高純度（宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合）和高產(chǎn)率（組氨酸標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合）之間的最佳平衡?？赡茉?：組氨酸的標(biāo)簽沒(méi)有完全的暴露?！咀⒁馐马?xiàng)】（1）樣品可貯存于4℃，以備在聚丙烯酰胺凝膠上加樣。（6）棄上清，向沉淀中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸緩沖液（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10% 甘油，pH ），充分懸浮洗滌菌體。（13）操作過(guò)程中禁止將液體濺入機(jī)箱內(nèi)部。待升降臺(tái)完全下降后，繼續(xù)降低壓力至零，關(guān)閉電源。 PRESS 細(xì)胞破碎儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（1）使用前將高壓腔、底座、活塞桿在4℃冰箱中預(yù)冷30min。常規(guī)操作步驟如下（以100ml 培養(yǎng)液為例）：（1）100 ml 誘導(dǎo)后的菌液（OD600= 左右），12000 rpm，4℃離心2min，收集菌體。（7）在上下電泳槽中加入足夠的電泳緩沖液。（2）（）溶液。SDSPAGE 分析上清和沉淀的蛋白分布（具體操作參考SDSPAGE）。（DE3）RIL, BL21CodonPlμs174。重組質(zhì)粒的構(gòu)建一般選擇遺傳穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率高，質(zhì)粒產(chǎn)量高的菌株作為受體菌， DH5α， JM 109， DH 10B ， NovaBlμe等recA–和endA–型細(xì)胞。大