【正文】 后發(fā)酵茶，茶葉中的黑曲菌和酵母菌等微生物在一定的溫度、濕度條件下，會不斷生長、發(fā)酵，逐漸變成茶紅素和茶褐素，產(chǎn)生一些對人體有益的成分。普洱茶通過其獨特的生產(chǎn)方式—渥堆發(fā)酵以及在貯藏陳化過程中，曬青毛茶原料中豐富的多酚類、糖類、蛋白質(zhì)等多種化合物在多種好氧和厭氧微生物以及水熱作用下發(fā)生一系列轉(zhuǎn)化。其中，以多酚類氧化產(chǎn)物為主的水溶性色素茶褐素是普洱茶湯中的最主要成分，是形成普洱茶獨特風(fēng)味的重要成分。茶葉中的色素化合物有存在于茶鮮葉中的天然色素以及加工過程中形成的色素，這些色素是茶葉色澤、湯色及葉底色澤的基礎(chǔ)[12]。目前的研究報道表明普洱茶抗氧化機制大致通過以下三個途徑:① 抑制或直接清除自由基的產(chǎn)生。Lin,(nitric oxide radicals)生成的能力[3]。Lin, ，保護(hù)DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，防止鏈斷裂[4]。揭國良等研究表明普洱茶水提物中的乙酸乙酯萃取層組分和正丁醇萃取層組分對DPPH和羥自由基均有較強的清除能力[5]。②抑制脂質(zhì)過氧化。普洱茶屬后發(fā)酵茶，綠茶屬不發(fā)酵茶。普洱茶渥堆的實質(zhì)是以曬青毛茶(綠茶)的內(nèi)含成分為底物，在微生物分泌的胞外酶的酶促作用、微生物呼吸代謝產(chǎn)生的熱量和茶葉水分的濕熱協(xié)同下，發(fā)生的茶多酚氧化、縮合、蛋白質(zhì)和氨基酸的分解、降解，碳水化合物的分解以及各產(chǎn)物之間的濕熱、縮合等一系列反應(yīng)，因此普洱茶與綠茶組成成分及抗氧化作用方面有較大差異。大量 的 ，但用超濾分離法得到的普洱水提物經(jīng)分析后得出高分子量物質(zhì)(MW300oDaltons)多于50%(w/W)，且普洱茶中沒食子酸的含量高于綠茶[67]。 普洱茶與紅茶相比,普洱茶在水相中的抗氧化能力無論在總體或單個組分上均略低于紅茶；兩類茶水提物對某些油脂具有較好抗氧化性；乙酸乙酯萃取組分對兩類茶在水相中的抗氧化性起主導(dǎo)作用，且紅茶略高于普洱茶，在油相中均無表現(xiàn)明顯抗氧化性[8]。開發(fā)和研制天然植物抗氧化劑，消除氧自由基對機體的損害作用，是目前醫(yī)藥和食品研究中的一個重點。目前，國內(nèi)主要是對普洱茶藥理作用、保健功效以及普洱茶品質(zhì)與化學(xué)成分關(guān)系進(jìn)行了大量研究，而在普洱茶的抗氧化性方面，國內(nèi)外鮮有研究報道。本試驗內(nèi)容：提取云南普洱茶及曬青毛茶不同溶劑提取物；制備不同濃度梯度的提取物待測樣；根據(jù)試驗條件選擇合適的清除自由基評價方法，明確評價云南普洱茶不同溶劑提取物體外抗氧化活性。2 材料與方法 試驗時間、地點本試驗于2007年10月2008年3月期間，在食品質(zhì)量與安全系食品分析室完成。云南普洱茶、曬青毛茶（來自勐海國艷茶廠） 主要試劑 本試驗中主要用到的藥品和試劑見表1。表 1主要藥品和試劑Table 1 Main drugs and reagants藥品和試劑出廠廠家無水乙醇天津市化學(xué)試劑三廠，分析純乙酸乙酯天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠氯仿天津市化學(xué)試劑三廠正丁醇天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司濃鹽酸上海吉象化學(xué)試劑有限公司，分析純鄰苯三酚即焦性沒食子酸國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司Tris即三（羥甲基）胺基甲烷國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司FeSO47H2O國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司水楊酸天津市化學(xué)試劑三廠30%過氧化氫天津市化學(xué)試劑三廠亞硝酸鈉天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司對氨基苯磺酸中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司N1萘乙二胺鹽酸鹽天津市化學(xué)試劑研究所三氯乙酸中國前進(jìn)化學(xué)試劑廠鐵氰化鉀中國成都化學(xué)試劑廠三氯化鐵天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司磷酸二氫鈉中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司Na2HPO412H2O天津市瑞金特化學(xué)品有限公司蘆丁成都思科華生物技術(shù)有限公司Vc南化化學(xué)試劑廠甲苯天津市化學(xué)試劑三廠，分析純DPPH美國SigmaAldrich公司 試驗儀器試驗中用到的主要儀器見表2。表 2主要儀器Table 2 Main equipents儀器名稱及規(guī)格出廠廠家722型分光光度計上海精密科學(xué)儀器有限公司電子天平（）沈陽龍騰電子有限公司HH60水浴鍋常州市普達(dá)教學(xué)儀器有限公司移液槍（）大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司SH10A水分快速測定儀上海恒平科學(xué)儀器有限公司1013ABS恒溫電熱干燥箱北京市永光明醫(yī)療儀器廠RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮儀器廠BCD208K/A海爾冰箱海爾集團(tuán)（青島） 研究方法 待測樣的提取及水分含量的測定 不同溶劑提取物的提取工藝普洱茶及其原料經(jīng)打碎過篩（4080目）→無水乙醇浸泡（23次，每次一天，溫度為45℃）→收集乙醇浸泡液→把茶葉晾干，揮去乙醇→加入蒸餾水（分三次浸泡，每次3小時，溫度為50℃，體積比為1：5）→合并濾液，過濾，除去雜質(zhì)，75℃減壓濃縮→取適量的水提物乙酸乙酯萃取3次（殘留水層）→三氯甲烷萃取23次（殘留水層）→正丁醇萃?。埩羲畬樱畬蛹訜o水乙醇沉淀，靜置1天，過濾得到沉淀和醇溶液。不同溶劑提取物均進(jìn)行減壓濃縮（回收溫度一般為：乙醇提取物，65℃；水提物，75℃；乙酸乙酯提取物，50℃；氯仿提取物，50℃；正丁醇提取物，70℃），經(jīng)濃縮的樣液置于55℃烘箱中烘干備用。 待測樣水分含量的測定采用傳統(tǒng)水分測定方法或采用SH10A水分快速測定儀測定待測樣品水分。傳統(tǒng)水分測定方法：稱量皿置于105℃干燥箱中加熱4小時冷卻至室溫稱量→取樣移入已知稱量皿中→將稱量皿置于105℃烘4小時,加蓋取出,冷卻后稱量→再加熱半小時,冷卻稱量(兩次連續(xù)稱量之差＜絕對值＞,即為恒重,以最小一次為準(zhǔn))。SH10A水分快速測定儀測定方法：根據(jù)SH10A水分快速測定儀的測定原理測定。因部分樣品提取的量相對較少而采用此方法。 普洱茶及其原料不同溶劑提取物的總抗氧化能力（還原力）的測定 配制試劑 mol／L，pH6．6磷酸緩沖溶液的配制：，加水溶解并定容到1L；準(zhǔn)確稱取Na2HPO4，加水溶解并定容到500 mL；量取磷酸二氫鈉溶液624mL及Na2HPO412H2O溶液376 mL，混合定容即可。1％鐵氰化鉀溶液的配制：，加水溶解并定容到250 mL即可。10％ 三氯乙酸溶液的配制：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸50g，加水溶解并定容到500 mL即可。％FeC13溶液的配制： g，加水溶解并定容到250 mL即可。 具體操作、 （ mL、 mL 、 mL、 mL、 mL） mL，加入0．2mol／L，pH6．6磷酸緩沖溶液2．5mL及1％ 鐵氰化鉀2．5mL，50℃水浴20min后急速冷卻，加入10％ 三氯乙酸溶液2．5mL， 加蒸餾水6mL，及0．1％FeC13 ，混勻后10min于700nm處測定吸光值， 吸光值越大則還原力越強[9]。 普洱茶及其原料不同溶劑提取物對OH的抑制率的測定 配制試劑： FeSO4，用蒸餾水溶解定容至100mL。6mmol/LH2O2的配制：準(zhǔn)確吸取30%，用蒸餾水定容到500mL,則為6mmol/L H2O2。2mmol/L水楊酸的配制：，用無水乙醇溶解定容至100mL。 實驗原理 按Smirnoff方法改進(jìn)，用FeSO4+ H2O2產(chǎn)生OH。以O(shè)H氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光值表示OH的多少，吸光度越大則OH越多。 具體操作，2mmol/L水楊酸1mL，不同濃度的提取物1mL（ mL、 mL、 mL、 mL、 mL加水至1 mL），最后加入6mmol/L H2O21mL啟動反應(yīng)。37℃反應(yīng)1h，測定510nm處的吸光值。吸光值越大，則清除OH效果越好[9]。按下式計算抑制率：抑制率（％）＝[A0（AiA0i）]/A0 100%式中：A0——用蒸餾水代替樣品的對照值；Ai——加樣后的吸光度；A0i——樣品本身的本底值 普洱茶及其原料不同溶劑提取物對[DPPH]自由基清除能力的測定[10] 實驗原理二苯代苦味肼基自由基[DPPH]是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，在517nm波長處有最大吸收。[DPPH]乙醇溶液呈紫色，其濃度與吸光度呈線性關(guān)。在[DPPH] 乙醇溶液中加入待測樣液后，待測樣液可以與[DPPH]自由基結(jié)合或發(fā)生替代，使[DPPH]自由基數(shù)量減少，溶液顏色變淺，表現(xiàn)為：其在517nm波長處的吸光度不斷減小，直至達(dá)到穩(wěn)定。因此，可以通過在517nm波長處檢測普洱茶對[DPPH]自由基的清除效果，計算其抗氧化能力。 [DPPH]貯備液的配制 準(zhǔn)確稱取4mg [DPPH]，先用少量甲苯助溶，再用50%乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用50%乙醇定容， mg/mL[DPPH]貯備液，現(xiàn)配現(xiàn)用。 具體操作、 mL、 mL、 mL、 mL待測溶液于試管中，分別加入0 mL、 mL、 mL、 mL、 mL蒸餾水， mL[DPPH]試劑，搖勻，靜置30min，測吸光度A。用1cm比色皿在517nm波長處測吸光值A(chǔ)值，記為As。將 mg/mL[DPPH]溶液用1cm比色皿在517nm波長處測吸光值A(chǔ)值，記為Ao，按以下公式計算自由基清除率 [1112] 。清除率（%）=（1 As/Ao）100% 普洱茶及其原料不同溶劑提取物對超氧陰離子自由基（02）的抑制率的測定 配制試劑50mmol/L TrisHCl 緩沖液的配制： Tris樣品，用蒸餾水定容于500mL容量瓶中，取250 mL此Tris溶液， 。3mmol/L鄰苯三酚溶液的配制：。 實驗原理 利用某些體系在氧化過程中有超氧陰離子自由基（02）的生成，02與某些化合物的作用，產(chǎn)生具有特定吸收的有色物質(zhì)，利用分光光度計進(jìn)行測定。受試物若能清除02，則吸光度發(fā)生變化，可間接判斷受試物對02的抑制作用。 鄰苯三酚在堿性條件下迅速自氧化，自氧化過程中產(chǎn)生02，02又加速鄰苯三酚自氧化速率，同時產(chǎn)生有色中間物質(zhì)，有色中間產(chǎn)物的積累在滯后3045s與時間成良好的線性關(guān)系，一般維持4min左右，隨后減慢。有色中間產(chǎn)物在322nm有強烈的光吸收。由于自氧化的速率依賴于02的濃度，消除02則抑制自氧化反應(yīng)，阻止中間產(chǎn)物的積累，