培訓(xùn)講義-修改后-文庫吧
2025-04-01 22:38 本頁面
【正文】 RNA殘留蛋白殘留拖尾降解 二、植物葉片總RNA的大量提取【實(shí)驗(yàn)原理】植物細(xì)胞內(nèi)的RNA主要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和 mRNA（占1～5％）。rRNA含量最豐富，由25S、18S和5S幾類組成。mRNA種類繁多，分子量從數(shù)百至數(shù)千堿基不等，但絕大多數(shù)mRNA在3’端都有一個polyA尾巴，因此，可根據(jù)此特性用寡聚脫氧胸苷(OligodT)層析柱從總RNA中將 mRNA分離出來。一般情況下，提取的總RNA也可用于Northern blot試驗(yàn)。已有多種較為成熟的分離總RNA的方法，常用的有3種。（1）苯酚法：用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；（2）鹽酸胍法：用異硫氰酸胍或鹽酸胍和β巰基乙醇變性蛋白，并抑制RNase的活性，經(jīng)酚氯仿抽提后再沉淀；（3）氯化鋰沉淀法：因?yàn)殇囋谠谝欢╬H下能使RNA相對特異地沉淀，但容易使小分子RNA損失，而且殘留的鋰離子對mRNA有抑制作用。采用Trizol 試劑盒提取總RNA，其原理是依據(jù)鹽酸胍法。Trizol法適用于動物、植物和微生物組織，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol 法提取的總RNA絕無蛋白和DNA 污染。RNA可直接用于Northern分析，Poly（A）分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆等。異硫氫酸胍：有效地RNAse抑制劑。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除；NaAc，Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少RNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。酸酚使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與核酸聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而核酸溶于水相。使用酚的優(yōu)點(diǎn)：；2抑制了DNase的降解作用。缺點(diǎn)：%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA。 氯仿：克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯仿中）?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹繌闹参锶~片組織中提取高質(zhì)量RNA?！局饕噭?M GT溶液：4M GT異硫氫酸胍（Guanidine thiocyanate），25m M 檸檬酸鈉（Sodium citrate），%(w/v) 十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)，高壓滅菌之后，（體積比大約為：%）2M NaAC（）3M NaAC4M LiCLDEPC H2O{v/v % DEPC處理的ddH2O（37℃處理12h以上，處理過程要不斷攪拌，高溫高壓滅菌去除殘留）} 或TE?！静僮鞑襟E】1. 植物組織1g，液氮研磨；2. 倒入50ml離心管中（管中事先放3ml的4M GT，冰?。?，震蕩混勻；3. 2M 的NaAC，震蕩混勻；4. 加入3ml酸酚（水飽和酚＋%(w/v)δ羥基喹啉δHydroxyquinoline），震蕩混勻；5. 加入1ml氯仿，震蕩混勻，6000rpm，13min，取上清；6. 加入2倍體積的乙醇，20度過夜（幾小時也可以，產(chǎn)量可能會低）；6000rpm，離心10min，棄上清，留沉淀；7. 加入1ml 4M的LiCL（）；13000rpm，1015min，留沉淀；8. ，溶解；9. 加入1/2體積的酸酚和1/2的氯仿，震蕩混勻；10. 13000rpm，離心5min，取上清液；11. 加入1倍體積的氯仿；13000rpm，離心5min，取上清液；12. NaAC和2倍體積乙醇；震蕩混勻，20度過夜；13. 13000rpm，離心5min，留沉淀；14. 沉淀RNA晾干，DEPC水或TE溶解（40—60ul）。注：RNA溶解時不要晾太干，會導(dǎo)致難以溶解?！綬NA甲醛電泳】試劑配制5X甲醛凝膠電泳緩沖液：（pH—）40mmol/L 乙酸鈉5mmol/L EDTA （pH—）注： MOPS溶于800ml經(jīng)用DEPC處理的50mmol/L乙酸鈉溶液（用DEPC處理），（pH—）再加經(jīng)用DEPC處理的水至溶液總體積為1L。高壓滅菌，室溫保存于棕色瓶子中（光照或高壓滅菌后溶液逐漸變黃，淡黃色的緩沖液可正常使用，而深黃色緩沖液則不然）。甲醛凝膠加樣緩沖液：50%甘油1mmol/L EDTA（pH—）%溴酚藍(lán)%二甲苯青FF電泳方法注： 所有用于配制與RNA接觸的溶液的水需預(yù)先經(jīng)DEPC處理。凝膠制備RNA甲醛變性凝膠濃度通常為1—%。%凝膠28ml：（1） 瓊脂糖， DEPC水，微波爐熔化；（2）冷卻至50—60℃，加入37%，EB 2ul（用于轉(zhuǎn)膜可以不加），混勻；（3） 倒膠，室溫放置30min以上，使膠徹底凝固；（4）RNA變性體系RNA 5X 甲醛凝膠電泳緩沖液 甲醛 甲酰胺 混勻，65℃15分鐘，迅速冰浴5分鐘，稍離心。加入甲醛凝膠加樣緩沖液2ul。（5）電泳過程A. 先將凝膠放入1X
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