蜂膠中摻雜物的鑒別——高效液相色譜指紋圖譜法標(biāo)準(zhǔn)編制說明-文庫吧
2025-03-30 07:30 本頁面
【正文】 原理是科學(xué)、可行的。5 本標(biāo)準(zhǔn)方法的優(yōu)選采用中藥指紋圖譜技術(shù)來鑒別蜂膠真?zhèn)问潜緲?biāo)準(zhǔn)制定的出發(fā)點(diǎn)，中藥指紋圖譜的測(cè)定方法有多種，綜合考慮操作簡便性、儀器成本等方面因素，我們選用了高效液相色譜（HPLC）方法。而自然界的絕大多數(shù)化合物都有紫外或可見光譜吸收，蜂膠中的功效成分黃酮類化合物在紫外光區(qū)吸收明顯。所以本標(biāo)準(zhǔn)的方法確定為：高效液相色譜紫外檢測(cè)法。 指紋圖譜檢測(cè)方法的建立 樣品處理方法優(yōu)選：蜂膠中的黃酮類化合物溶于甲醇，但是在水中微溶或者不溶，我們選擇了10%、20%、40%、60%、80%等不同濃度的甲醇溶液提取蜂膠的黃酮類化合物，采用《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）中《保健食品中總黃酮的測(cè)定方法》測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：60%的甲醇即能較完全地提取蜂膠中的黃酮類化合物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇濃度的增加，蜂膠中的更多低極性的物質(zhì)也會(huì)被提取。據(jù)現(xiàn)有的采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法和液相色譜紫外檢測(cè)法測(cè)定蜂膠中黃酮類化合物含量的測(cè)定方法中，樣品前處理多用純甲醇，而流動(dòng)相中的甲醇含量多為60%，由于前處理時(shí)，純甲醇提取的蜂膠中的其他低極性的組分在60%的甲醇溶液里易析出，從而堵塞和污染色譜柱，并影響各物質(zhì)間的有效分離。本標(biāo)準(zhǔn)方法中，先用甲醇溶解樣品，使蜂膠成為極稀溶液，充分溶出有效成分，% H3PO4混勻，沉淀雜質(zhì)，甲醇與磷酸的比例與流動(dòng)相一致，最后用流動(dòng)相定容，確保前處理樣液中的溶劑與流動(dòng)相一致，這樣，樣液經(jīng)過含有流動(dòng)相的色譜柱時(shí)不會(huì)有物質(zhì)析出，不會(huì)堵塞污染色譜柱，延長了柱子壽命。樣品取樣量的確定，由于樣品中蜂膠含量不一樣，稱取相同量的樣品，最后的色譜峰面積會(huì)存在明顯的差異，影響特征峰之間的比較和定性。故先對(duì)總黃酮進(jìn)行定量測(cè)定后，確定有效成分的含量，再據(jù)此確定取樣量，可以保證在同一濃度水平比較指紋圖譜，使得定性更加準(zhǔn)確。優(yōu)化后的樣品前處理方法為：按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）中保健食品中總黃酮的測(cè)定方法預(yù)檢測(cè)樣品中的總黃酮含量，總黃酮含量為20%的樣品稱取50mg或相當(dāng)量（所稱樣品中總黃酮含量為10mg）,放入50ml容量瓶中，加入9ml甲醇，充分溶解樣品，必要時(shí)可以超聲波助溶，再加入6ml %磷酸,混勻溶解后，用流動(dòng)相定容,搖勻，經(jīng) ，取續(xù)濾液即得。 液相色譜條件優(yōu)化： 色譜柱的優(yōu)選。我們?cè)诜淠zHPLC 指紋圖譜真?zhèn)舞b別研究中，分別采用依利特Hypersil C18 、艾杰爾Venusil MP C1安捷倫Zorbax C1迪馬C1思譜C18等色譜柱作為分離柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hypersil C18等色譜柱對(duì)蜂膠特征峰的分離效果不夠理想。而采用Venusil MP C18作為分離柱，分離效果良好。鑒于不同色譜柱對(duì)各種成分分離行為差異較大，故本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了色譜柱使用的規(guī)格和型號(hào)為：Venusil MP C18 250mm,5181。m。各種色譜柱分離色譜圖見圖1。34521 2. 依利特 4. 迪馬 5. 艾杰爾。%H3PO4作為流動(dòng)相，考慮60%甲醇提取樣品時(shí)雜質(zhì)較少，能夠有效提取黃酮類化合物，故確定了甲醇：%H3PO4 = 60:40的流動(dòng)相比例。經(jīng)過試驗(yàn)表明，可達(dá)到較好的分離效果。由于具有2苯基色原酮的基本結(jié)構(gòu)，黃酮類化合物具有特定的紫外吸收峰，常有兩個(gè)較強(qiáng)的吸收帶，I帶在300—400nm范圍內(nèi)，它是由于B環(huán)桂皮?；鸬模驇?40—285nm范圍內(nèi)，它是由于A環(huán)上的苯甲?；鸬?。根據(jù)目前現(xiàn)有檢測(cè)黃酮類化合物的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)，我們選擇性地采用了254nm、276 nm、 280 nm、 360 nm、 415 nm等不同波長對(duì)樣液進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)360nm波長下的色譜峰信息豐富、適中，蜂膠與楊樹膠指紋特征差異明顯，且各特征峰之間分離良好，符合中藥指紋圖譜對(duì)峰信息的基本要求，故選擇360nm作為本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)波長。優(yōu)化后的液相色譜條件如下：色譜柱：Venusil MP C18 250mm,5181。m或相當(dāng)者；流動(dòng)相：甲醇：%H3PO4 = 60:40流速：檢測(cè)波長：360nm進(jìn)樣量：5ul 鑒別技術(shù)參數(shù)確定： 各種蜂膠指紋圖譜的特征色譜圖精密度、重現(xiàn)性的確定以及15個(gè)指紋特征峰的確定。，記錄120min內(nèi)的指紋圖譜，為滿足指紋圖譜相似度測(cè)定的要求，在重復(fù)性條件下對(duì)同一試液連續(xù)進(jìn)行五次測(cè)定，要求各主要特征峰的保留時(shí)間的RSD%,各主要特征峰的峰面積的RSD3%。表1和表2分別為在島津高效液相色譜系統(tǒng)LC10A上，6個(gè)樣品的15個(gè)特征峰保留時(shí)間和峰面積的RSD值。表1. 6個(gè)樣品的15個(gè)特征峰保留時(shí)間的RSD值峰號(hào)樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5樣品6123456789101112131415表2. 6個(gè)樣品的15個(gè)特征峰面積的RSD值峰號(hào)樣品1樣品2樣品3樣品4樣品5樣品6123456789101112131415根據(jù)多次測(cè)定結(jié)果，選擇了15個(gè)蜂膠指紋圖譜中的共有峰，作為計(jì)算相似度的主要特征色譜峰。見圖2。圖2 蜂膠對(duì)照指紋圖譜1:咖啡酸 2:蘆丁 3：楊梅酮 4：槲皮素 7：莰菲醇 8：芹菜素 10：松屬素 14：柯因 15：高良姜素根據(jù)多次測(cè)定結(jié)果，確認(rèn)楊樹膠中除了不含有1號(hào)峰（咖啡酸色譜峰）外，含有蜂膠的其余14個(gè)特征峰，可作為用于計(jì)算相似度的主要特征色譜峰。見圖3。圖3 楊樹膠對(duì)照指紋圖譜2:蘆丁 3：楊梅酮 4：槲皮素 7：莰菲醇 8：芹菜素 10：松
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