【正文】 不雜亂，沒有動物所特有的疾病，如脫腳?。ㄊ?痘）、流行性腹病毒、致死性腸道病毒、 Pillifomis 菌、出血性敗血性巴斯德菌、支氣管敗血性傳代菌感染、絲蟲病、球蟲病、蠕蟲（除蛔蟲外）病等。 Ⅲ級：即所謂無特定病原體（ Specific Pathogen free,SPF）動物，除Ⅱ級標準外，動物為部腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)，均按純系要求繁殖，在隔離器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng)，只有一些不致病的細菌叢，沒有各種致病的病原體。 Ⅳ級：即無菌（ Germ free,GE）動物，在全封閉無菌條件下飼養(yǎng)的純系動物，動物體內(nèi)外不帶有任何微生物和寄生蟲（包括絕大部分病毒）。 Ⅲ級及Ⅱ級 動物的要求較高也較貴，只宜用于特殊目的和要求的實驗。 最近國內(nèi)實驗動物專家和科技工作者研究認為，現(xiàn)在我國醫(yī)學實驗動物分為四級：一級為普通動物；二級為清潔動物；三級為無特定原體動物；四級為無菌 9 動物和悉生動物。 普通動物（ CV）要求必須不帶有人獸共患病原體及體外寄生蟲。清潔動物（ CL）要求在 CV 的基礎(chǔ)上，還須不帶有動物傳染病的病原體。無特定病原體動物（ SPF）要求在 CL 基礎(chǔ)上還須不帶有干擾實驗的微生物。無菌動物（ GF）要求不帶有任何用現(xiàn)有的方法可以檢出的微生物。悉生動物（ GN）要求在無菌動物體上植入一種或數(shù)種已 知的微生物。 2．易感性高。 3．品種、年令和體重合乎要求。 工序二 ： 種毒與接種 1. 種毒：致死力強大的自然毒株的臟器組織毒或強毒株的增菌培養(yǎng)物，也可用弱毒株組織毒種。必須檢查合格后使用。 2. 接種途 徑 ：腦內(nèi)注射、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射 等 。 工序三 ： 觀察與收獲 根據(jù)觀察征象和檢查的結(jié)果選出符合要求的發(fā)病動物按規(guī)定方式剖殺，采取收集含毒高器官組織。 工序四 ： 制苗 1. 組織滅活疫苗：收獲的組織經(jīng)無菌檢驗及毒價測定合格后按比例加入滅活劑制成勻漿，然后按不同病毒的滅活溫度、時間進行滅活或脫毒。 2. 弱毒組織疫苗：無 菌取組織、稱重、剪碎、加保護劑，過濾、稀釋，檢查（檢菌、毒價）、鑒定、分裝、凍干。 b) 病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制造 工序一 ： 雞胚選擇 受精卵必須來自 SPF 雞群，最低也應(yīng)來源于未用抗生素藥物的非免疫雞。受精卵從孵育至培養(yǎng)全過程應(yīng)保持無菌，接種日齡視病毒而定。 工序二 ： 種毒與毒種繼代 工序三 ： 接毒與收獲 1．接毒：接毒途徑和接毒量，視不同病毒不同。 2．培養(yǎng) 10 3． 收獲病毒 工序四 ： 配苗 收獲的胚液、胎兒和絨毛尿囊膜乳劑經(jīng)無菌檢驗合格后配苗。 注： 濕苗：于雞胚液中加青、鏈霉素（每 ml500~1000u）放置 0~10℃，冷處理后分裝。 凍干苗：按比例加入保護劑（ 5%蔗糖脫脂乳）、濾過、加青鏈霉素、分裝、凍干。 c) 病毒性細胞培養(yǎng)疫苗制造 工序一： 種毒與毒種繼代 制苗用種毒應(yīng)經(jīng)毒力、最小免疫量、安全性、無菌檢驗合格，多為凍干品。指定部門提供。領(lǐng)取的種毒應(yīng)按規(guī)定在細胞繼代適應(yīng)后作毒種，并應(yīng)按規(guī)定控制在一定代數(shù)之內(nèi)。 工序二 ： 營養(yǎng)液配制 分細胞培養(yǎng)用生長液（含 5%~10%血清）和病毒培殖用的維持液（ 2%~5%血清），不同細胞所需營養(yǎng)液不同，但內(nèi)均含多種 氨基酸 、 維生素 和一些有機物、無機物，并有商品粉劑出售 。只需溶解后經(jīng)除菌處理即可。 工序三 ： 細胞制備 （分原代細胞和繼代細胞） 選擇依據(jù)： 1. 病毒的適應(yīng)性高、毒價高。 2. 細胞來源方便，制備簡備，生命力強。如豬瘟兔化弱毒牛睪丸細胞疫苗用犢牛睪丸原代細胞，狂犬病弱毒細胞適應(yīng)疫苗，采用 BHK21。 制備細胞程序： 原代細胞將動物器官用胰蛋白酶消化，要裝培養(yǎng)成單層，如為凍干，可按細胞數(shù)分裝，擴增培養(yǎng)。常用細胞培養(yǎng)方法為靜止培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)我國仍處于試驗之中。用傳代細胞培養(yǎng)應(yīng)注意不要用種瘤細胞。 工序四： 接毒與收獲 11 病毒接種有同步和異步。培養(yǎng)當出現(xiàn) 70%~85%以上細胞病孌時，即可收獲。細胞毒液經(jīng)無菌檢驗，毒價測定合格后供配苗用。 工序五： 配苗 1．滅活疫苗：不同病毒采用不同滅活劑，有的需加佐劑，分裝。 2．凍干苗：加保護劑或穩(wěn)定劑、混合、分裝、凍干 。 5) 典型疫苗 的 生產(chǎn)工藝流程 根據(jù)以上總結(jié)的制造疫苗的各項操作步驟，益康員工給我們重點介紹了幾種疫苗的生產(chǎn)工藝流程。首先來了解下前兩種疫苗的起始原料 SPF 蛋。 SPF 蛋： SPF 為 specific pathogen free 的縮寫意思為無特定病原體， SPF 雞蛋既是由無特定病原體雞下的，無特定病原體雞蛋。 SPF 雞卵作為生物制品的原材料 ,對生物制品的質(zhì)量影響力是不言而喻的。由于我國獸藥實施 GMP 管理 ,SPF 雞卵的需求量大增。 2020 年年底 ,中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所成功研制出禽流感 新城疫重組二聯(lián)活疫苗 (rLH5 株 ),年需 SPF 雞卵 300 萬枚 ,使得目前 SPF 雞卵供應(yīng)較為緊張。 20 世紀 80 年代 ,農(nóng)業(yè)系統(tǒng)進行 SPF 雞技術(shù)的開發(fā)研究。 20 多年來 ,SPF 雞、SPF 雞蛋已在獸用生物制品企業(yè)推廣使用 ,并取得了較好的經(jīng)濟效益。特別是2020 年中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第 202 號、 2020 年中華人民共和國國務(wù)院令第 404 號和中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第 442 號頒布以來 ,SPF 雞蛋和 SPF 雞的使用量明顯增加 (據(jù)不完全統(tǒng)計 ,2020 年全國使用 SPF 雞為 28 348 只 ,2020 年約 73 000 只 ),正負壓 SPF 雞隔離器的數(shù)量也明顯增多 (2020 年為 96 臺 ,2020 年為 1 232臺 ),SPF 雞蛋的生產(chǎn)和銷售正向產(chǎn)業(yè)化、專業(yè)化邁進。 根據(jù)益康工作人員的介紹，我們知道他們廠所用的 SPF 蛋都是他們廠自己生產(chǎn)的，因為他們有自己的 SPF 養(yǎng)雞舍，這樣對他們來說是很好的，因為自己廠子生產(chǎn)的蛋用著比較放心，而且最重要的是避免了雞蛋在運輸途中的變 質(zhì)以及破損等事情的發(fā)生，增加了產(chǎn)品的質(zhì)量也減少了經(jīng)濟損失。 12 ⒈ 雞胚培養(yǎng)弱毒疫苗生產(chǎn)工藝流程 蛋庫（ SPF 蛋） 脫外包 接毒 雞胚前孵化 蛋表面消毒 后孵化 冷蛋（ 4℃ ） 收獲病毒 配苗 裝箱 貼標 軋蓋 壓塞 分裝 入庫 15℃ 滅菌 凍干保護劑 標簽 滅菌 粗洗 清洗 膠塞 鋁蓋 配制 配制 滅菌 照蛋 中間品檢驗 病毒液暫存 15℃ 化苗 照蛋 滅菌 西林瓶 精洗 精洗 成品檢驗 粗洗 凍干干燥 半壓塞 13 ⒉ 細胞培養(yǎng)弱毒疫苗生產(chǎn)工藝流程 蛋庫（ SPF 蛋） 脫外包 接毒 雞胚孵化 蛋表面消毒 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 177。 1℃ 收獲病毒 制細胞懸液 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 177。 1℃ 照蛋 轉(zhuǎn)瓶 滅菌 晾干 精洗 粗洗 培養(yǎng)液 冷庫 15℃ 解凍 28℃ 病毒液暫存 15℃ 化苗 配苗 中間品檢驗 分裝 凍干保護劑 配制 滅菌 滅菌 西林瓶 精洗 粗洗 裝箱 貼標 軋蓋 壓塞 入庫 15℃ 標簽 滅菌 清洗 鋁蓋 成品檢驗 滅菌 粗洗 膠塞 精洗 凍干干燥 半壓塞 14 ⒊菌種培養(yǎng)弱毒疫苗生產(chǎn)工藝流程 6) 舉例說明 雞新城 疫苗的 使用 方法： a) 飲水免疫 首先要保證足夠的飲水器，并把飲水器清洗干凈， 達到 無抗菌、消毒藥物殘留；飲水免疫前停水 2~4 小時；疫苗水中不含金屬離子和氯離子，可使用涼開水或蒸餾水，最 好使用去離子水，并在其中加入 2~3%鮮牛奶或 ~%脫脂奶粉，以穩(wěn)定病毒活性。然后按要求加入疫苗，混勻后給雞飲服。 菌種 發(fā)酵罐培養(yǎng) 收毒 中間品檢驗 種子培養(yǎng) 培養(yǎng)基 滅菌 裝箱 貼標 軋蓋 壓塞 入庫 28℃ 標簽 滅菌 鋁蓋 成品檢驗 清洗 病毒液暫存 15℃ 化苗 配苗 分裝 凍干保護劑 配制 滅菌 滅菌 西林瓶 精洗 粗洗 滅菌 粗洗 膠塞 精洗 凍干干燥 半壓塞 15 特別注意疫苗的用水量，一般為雞日飲水量的 30%，疫苗用量高于平均用量的 2~3 倍，保證所有的雞同時喝到疫苗水，并在 ~1 小時內(nèi)飲完。如飲水量少，只能讓一部分雞飲上疫苗，造成免疫不均勻；飲水量太多，很長時間飲不完，造成疫苗效價降低。 b) 滴鼻點眼免疫 疫苗稀釋要用蒸餾水或生理鹽水，用量與配量相匹配。滴鼻點眼時將疫苗準確地滴在眼內(nèi)或鼻內(nèi)，等疫苗確實進入鼻、眼內(nèi)才把雞放回地面，以免疫苗被雞甩出 ，造成免疫不確實。如果滴眼時雞剛好閉眼、滴鼻時雞打噴嚏或鼻孔產(chǎn)生氣泡現(xiàn)象，必須重復(fù)接種。 c) 刺種免疫 選擇翼膜上羽毛少和血管較少的部位接種。刺種時，刺針針尖向下，使藥液自然下垂，避開血管，肌肉和骨骼，使刺種針垂直刺入翼膜。 d) 氣霧免疫 主要在大群免疫時應(yīng)用，但不適宜于 30 日齡內(nèi)的雛雞和存在慢性呼吸道病的雞群，以免誘發(fā)呼吸道系統(tǒng)疾患。氣霧免疫時，將疫苗按規(guī)定稀釋好，用噴霧器或空壓機將疫苗液噴成氣霧粒子。一般對 6 周齡以內(nèi)的雛雞氣霧免疫，氣霧粒子為 50μ m，而對 12 周齡雛雞氣霧免疫時，氣霧粒子取 10~30μ m為宜。 在雞頭上為約 米左右噴霧，噴完后要最大限度地降低通風換氣量，以保證氣霧免疫效果，同時也要防止通風不良而造成 窒息死亡，一般噴霧后密閉雞舍 10~20分即可。 e) 注射免疫 注射前要將注射器具徹底消毒，疫苗現(xiàn)配現(xiàn)用，疫苗用滅菌生理鹽水或涼開水稀釋，不能用熱水或含氯的自來水作稀釋液，滅活疫苗要搖勻后才能使用；注射劑量要準確，不能任意加大或減少疫苗用量；注射時操作要規(guī)范，頸部皮下注射應(yīng)提起皮膚掌握好角度，針頭刺入皮膚與肌肉之間，避免刺傷頸骨或穿針；肌肉注射應(yīng)根據(jù)雞齡大少確定實施部位，一般胸部龍骨肌肉最厚處注射， 避免破血管或內(nèi)臟器官，造成骨骼損傷及死亡，腿部注射應(yīng)在腿外側(cè)無血管處，進針時順腿骨方向刺入，避免刺傷血管神經(jīng)。 由于 我們是 7 月份參觀的益康，這個時期正是他們停產(chǎn)的時期，所以很多車 16 間我們都沒有參觀到。最后我們還去了 后續(xù)處理 車間（圖 4），在那里我們參觀了很多大的反應(yīng)罐， 比在課本中的更形象。激發(fā)了我們對發(fā)酵罐知識點的回憶。由于停產(chǎn)，所以一些罐子正在維修 中 （圖 4） 。 圖 3 圖 4 三、 實習 小結(jié) ： 這次去益康，我們收獲頗多， 由于他們實驗室的潔凈程度特高，要進去得經(jīng)過好幾層的消毒，而且還要穿防護服，所以我們沒有進去 參觀，不過通過他們的微機監(jiān)控室我們也能夠清楚的看見各個車間都是做 什么的，再加上工作人員的認真講解，我們學到很多課本上沒有的知識，也將有些學過的知識結(jié)合與實踐相結(jié)合。親身體會到那么大的罐體，更加深了我們對生物反應(yīng)罐的認識。 就這樣我們結(jié)束了為期半天的益康參觀實習， 七月六號 上午我們?nèi)チ松蜿枛|北制藥廠。 實習地點㈡ ： 東北制藥廠 VC 總公司 一、 吳春江老師 向我們 介紹 東北制藥廠 ： 東北制藥集團有限責任公司創(chuàng)建于 1936 年，是中國化學制 藥工業(yè)的搖籃，是我國最大的以化學合成為主、兼有生物發(fā)酵和制劑產(chǎn)品的綜合性制藥工業(yè)企業(yè)之一，也是中國醫(yī)藥產(chǎn)品重要的生產(chǎn)和出口基地。 東北制藥具備強大的生產(chǎn)能力，企業(yè)技術(shù)裝備先進，主導產(chǎn)品的各項經(jīng)濟技術(shù)指標均處于國際、國內(nèi)先進水平。該公司擁有全球最大的單條萬噸級維生素 C 17 生產(chǎn)線以及享有自主知識產(chǎn)權(quán)的全化學合成黃連素等產(chǎn)品，硫糖鋁、金剛烷胺和金剛乙胺三個產(chǎn)品順利通過了美國 FDA 認證檢查。 通過實施觀念創(chuàng)新、思維創(chuàng)新、制度創(chuàng)新、技術(shù)創(chuàng)新和管理創(chuàng)新，東北制藥初步形成了獨具特色的企業(yè)創(chuàng)新理論指導體系。經(jīng)過多年的實踐，該公 司在維生素 C 生產(chǎn)過程中從發(fā)酵、提取、轉(zhuǎn)化、精制等流程著手，大膽進行新工藝、新技術(shù)、新設(shè)備的研究創(chuàng)新，自發(fā)研制了兩步發(fā)酵法和堿轉(zhuǎn)化新工藝，填補了國內(nèi)空白。 在萬噸級維生素 C 生產(chǎn)裝置的實際應(yīng)用中，該公司設(shè)計采用了 300 立方米氣升式發(fā)酵罐，為國內(nèi)首創(chuàng)；同時引進了具有世界先進水平的超濾裝置，并采用先進