《蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)》ppt課件-文庫(kù)吧
2025-01-02 10:02 本頁(yè)面
【正文】 /11 11 小改 —— 少數(shù)殘基的替換 ? 定義： 小改 是指對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行少數(shù)幾個(gè)殘基的替換，這是目前蛋白質(zhì)工程中最為廣泛使用的方法。 ? 采用的方法： 主要通過(guò) 定點(diǎn)突變技術(shù) 或 盒式替換技術(shù) 有目的改變幾個(gè)氨基酸殘基，借以研究和改善蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能。 2022/2/11 12 小改 —— 兩個(gè)層次 ? 1． 已知立體結(jié)構(gòu) 基礎(chǔ)上所進(jìn)行的工作，直接將立體結(jié)構(gòu)信息與蛋白質(zhì)的功能相關(guān)聯(lián)的高層次的設(shè)計(jì) ? 2．借助蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)，在 未知立體結(jié)構(gòu) 的情形下所進(jìn)行的分子設(shè)計(jì)工作 ? 本部分只介紹第一種，實(shí)際上第一種已經(jīng)包含第二種，第二種只是在不得已的情況下采取的一種努力。 2022/2/11 13 例一：核糖核酸酶 小改 —— 舉例 ? 結(jié)構(gòu)知識(shí) ：核糖核酸酶含有 104個(gè)氨基酸殘基，該天然酶具有兩對(duì)二硫鍵（ Cys2Cys10， Cys6Cys103）。 ? 小改設(shè)計(jì)： 在不失去酶活性的基礎(chǔ)上增加它的穩(wěn)定性 ，日本大阪大學(xué)蛋白質(zhì)工程研究所的Satoshi Nishikawa等人嘗試在 Tyr（酪氨酸） 24和 Asn（天冬酰氨） 84位 引入 第三個(gè) 二硫鍵 。 2022/2/11 14 ? 分子設(shè)計(jì)和理論驗(yàn)證 ：從該酶晶體結(jié)構(gòu)可以看出這兩個(gè)殘基是 遠(yuǎn)離催化位點(diǎn) 的，經(jīng)過(guò) 分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算證明 在這兩個(gè)殘基之間有可能形成二硫鍵，并且不會(huì)影響催化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。并且采用 分子力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)方法 從核糖核酸的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)建立起核糖核酸突變體的模型。 ? 將 Tyr24和 Asn84兩個(gè)殘基側(cè)鏈（保留 Cβ ， Cγ ）消除，將Cγ 轉(zhuǎn)變?yōu)?Sγ 。 P3 ? 然后經(jīng)過(guò) 1000輪突變部位能量最小化和 2022輪整體能量最小化以及分子動(dòng)力學(xué)模型建立突變體的結(jié)構(gòu)模型，結(jié)構(gòu)模型中沒(méi)有不合理的鍵長(zhǎng)、鍵角和二面角。從設(shè)計(jì)的角度看這個(gè)突變是合理的。 ? 方案的實(shí)施 ：通過(guò) 基因技術(shù) 得到突變體，實(shí)驗(yàn)證明突變體在保持天然酶活性的基礎(chǔ)上大幅度提高了酶的熱穩(wěn)定性。 2022/2/11 15 例二： T4噬菌體溶菌酶 小改 —— 舉例 ? 結(jié)構(gòu)知識(shí) ：包含 164個(gè)氨基酸殘基，該酶不存在二硫鍵，只有Cys54和 Cys97兩個(gè)半胱氨酸。 ? 分子設(shè)計(jì) ： Matthews等人經(jīng)過(guò)仔細(xì) 比較 和 最小化計(jì)算 設(shè)計(jì)引入 3對(duì)二硫鍵 ， 6個(gè)半胱氨酸除了 Cys97外，其它 5個(gè)半胱氨酸由 Ile Ile Thr2 Thr142和 Leu164突變而來(lái)。 ? 結(jié)果 ：得到了全部單個(gè)二硫鍵（ 3－ 97， 9－ 164， 21－ 142）以及 2個(gè)和 3個(gè)二硫鍵的突變體。 2022/2/11 16 ? T4溶菌酶和 6種設(shè)計(jì)的突變體特性 ? 酶 氨基酸的位置 二硫鍵的數(shù)目 相對(duì)活性 Tm ? 3 9 21 54 97 142 164 (%) (℃ ) ? wtα Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 ? pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 ? A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 ? B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 ? C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 ? D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 ? E Ile Cys Cys Thr Ala Cys
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