【正文】 de 或sox17:Dendra 胚胎中定點(diǎn)激活單一類型的預(yù)定前體細(xì)胞，然后立即利用FACS 技術(shù)分選紅色熒光細(xì)胞； B）細(xì)胞分選后立即提取總 RNA 并制備芯片探針，通過基因芯片分析獲得并確證 肝臟 、腸道兩種預(yù)定的前體細(xì)胞之間及其分別與原腸中末期內(nèi)胚層細(xì)胞的差異表達(dá)基因。 2） 差異表達(dá)基因的功能及作用機(jī)理 研究。 A）在差異表達(dá)基因克隆并經(jīng)定量PCR 確證后，首先將研究基因的表達(dá)模式，力爭獲得 10 體節(jié)以前預(yù)定的肝臟和腸道前體細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記； B）研究 mRNA 過表達(dá)、 morpholino敲降、內(nèi)胚層特異性 morpholino 敲降后的胚胎表現(xiàn)型及其對肝臟和腸道不 9 同發(fā)育時(shí)期的分子標(biāo)記表達(dá)的影響； C）對于重要功能因子制備特異性抗體，并運(yùn)用酵母雙雜交、免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀（對轉(zhuǎn)錄因子或結(jié)合在染色質(zhì)上的蛋白復(fù)合物成員）篩選其相互作用因子或染色質(zhì)附著位點(diǎn)，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、蛋白相互作用調(diào)控三個方面研究這些因子調(diào)控肝臟和腸道早期發(fā)育的分子機(jī)理。 3. 肝細(xì)胞命運(yùn)決定后調(diào)控 肝臟發(fā)育基因 的 篩選與功能研究。 1） 肝臟 發(fā)育 不同 時(shí)期的差異表達(dá)基因的芯片篩選 。 機(jī)械分離 前腸內(nèi)胚層區(qū)域 組織后， 利用 FACS 技術(shù)分離 gutGFP 斑馬魚 的 14hpf、 24 hpf、 48 hpf、 72 hpf和 96 hpf 胚胎中攜帶 GFP 的細(xì)胞，提取總 RNA 后制備探針 進(jìn)行基因芯片分析，獲得并確 證 差異表達(dá)基因。 2） 差異表達(dá)基因的功能和作用機(jī)理研究。 對于 通過基因芯片 獲得 的 新基因 ，我們 將 利用基因 過表達(dá) 和敲降 、 內(nèi)胚層特異性敲降、 整體原位雜交、 免疫組化 、酵母雙雜交、免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀等方法 研究 新基因的 功能 及其作用機(jī)理 。 4. 利用胚胎干細(xì)胞體系研究肝前體及肝細(xì)胞體外分化的分子機(jī)理。 1） 胚胎干細(xì)胞向肝臟前體細(xì)胞分化過程中命運(yùn)決定的分子機(jī)理 。 A） 建立報(bào)告體系，標(biāo)記肝臟前 體細(xì)胞 。 Afp 的表達(dá)標(biāo)志著內(nèi)胚層細(xì)胞進(jìn)一步分化為肝臟前體細(xì)胞，因此我們將采用同源重組的方式，建立 afp 啟動子驅(qū)動報(bào)告基因表達(dá)的胚胎干細(xì)胞系。利用該細(xì)胞系，我們可 以定量判斷肝臟前體細(xì)胞的分化效率，并對肝臟前體細(xì)胞進(jìn)行分離純化 ； B） 研究關(guān)鍵信號通路 FGF 和BMP 在分化過程中的作用 。 我們已經(jīng)基本建立了胚胎干細(xì)胞向肝臟細(xì)胞定向分化的體系，整個分化過程與肝臟體內(nèi)發(fā)育過程相對應(yīng)，可分為三個階段：第一、 胚胎干細(xì)胞向內(nèi)胚層細(xì)胞分化階段 ，第二、 內(nèi)胚層細(xì)胞向肝臟前體細(xì)胞分化階段 ，第三、 肝臟前體細(xì)胞向成熟肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化階段。我們 初步研究發(fā)現(xiàn)， FGF 和 BMP 信號通路在內(nèi)胚層細(xì)胞向肝臟細(xì)胞命運(yùn)決定過程中可能起到關(guān)鍵的作用。進(jìn)一步，我們將對 FGF 和 BMP 信號通路及其下游重要 10 信號通路 在胚胎干細(xì)胞向肝臟細(xì)胞分化過程中的功能進(jìn)行深入分析。通過配體激活或者小分子抑制的方式，對這些候選下游信號進(jìn)行特異性的激活或抑制，并通過免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、 RTPCR 等方式檢測這些信號分子對向肝臟前體細(xì)胞的分化和增殖能力的影響。這些分析有助于進(jìn)一步闡明 FGF和 BMP 信號通路在促進(jìn)胚胎干細(xì) 胞向肝臟前體細(xì)胞命運(yùn)決定的分子機(jī) 理 。 2） 胚胎干細(xì)胞來源的肝臟前體細(xì)胞的基因 表達(dá)特性分析，影響其定向分化的關(guān)鍵基因的尋找及作用機(jī)理研究 。 A） 尋找表面標(biāo)記，用于分離 純化肝臟前體細(xì)胞 。 通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法，尋找肝臟前體細(xì)胞的表面分子標(biāo)記，并利用此標(biāo)記，對分化 得到的肝臟前體細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選，從而分離并純化肝臟前體細(xì)胞 ； B） 尋找調(diào)控肝臟前體細(xì)胞形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 。 我們將通過基因芯片的方法，對分選得到的肝臟前體細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析，并與之內(nèi)胚層細(xì)胞階段和肝實(shí) 質(zhì)細(xì)胞階段進(jìn)行比較，從而尋找調(diào)控肝臟前體細(xì)胞形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 ； C） 研究關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在胚胎干細(xì)胞向肝臟細(xì)胞分化過程中的功能 。 利用 Teton 調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)，建立重要候選基因可誘導(dǎo)表達(dá)的人類胚胎干細(xì)胞系，并在分化的不同時(shí)間點(diǎn)激活這些基因的表達(dá)，以分析這些基因?qū)θ祟惻咛ジ杉?xì)胞向肝臟細(xì)胞分化的影響；我們還將利用 RNA 干涉技術(shù)（ RNAi）進(jìn)行 lostoffunction 的研究，對這些基因的功能進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。 3） 胚胎干細(xì)胞來源的肝臟前體細(xì)胞的體外分化能力及分子機(jī)理研究。根據(jù)體內(nèi)發(fā)育研究中已有的部分線索，尋找可能參與細(xì)胞分化調(diào)控的信號通路，并分別通過配體激活或者小分子抑制，調(diào)節(jié)特定信號通路的活性，進(jìn)一步分析這些信號通路對肝臟前體細(xì)胞向肝實(shí)質(zhì) 細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化的影響，從而尋找調(diào)控前體細(xì)胞向肝、膽兩譜系進(jìn)行分化的關(guān)鍵信號通路。 5. 組蛋白 H3的 N端 三甲基化表觀遺傳調(diào)控機(jī)制 在由胚胎干細(xì)胞到 肝細(xì)胞分化過程 中的功能。 1） 肝干細(xì)胞的形成與分化中組蛋白 H3 N 端 三甲基化與染色質(zhì)形成的關(guān)系 。 在肝細(xì)胞分化的不同階段 檢 測 細(xì)胞內(nèi)組蛋白 H3 N端 三甲基化與染色質(zhì)形成的 11 關(guān)系，確定染色質(zhì) —— 組蛋白 H3 N 端 三甲基譜。 2） 肝細(xì)胞 特異的組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶的克隆 。 利用 RTPCR 分析不同分化階段肝細(xì)胞內(nèi) 各種 組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶表達(dá)， 克隆 相應(yīng)階段肝細(xì)胞內(nèi)特異的組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶。 3） H3 N 端三甲基化在從胚胎干細(xì)胞到肝細(xì)胞分化過程中的表觀遺傳穩(wěn)定性及功能的系統(tǒng)研究。 A）利用 N 端三甲基化的 組蛋白 H3 抗體和小鼠全基因組基因芯片，在肝細(xì)胞分化的不同時(shí)期將染色質(zhì)免疫共沉淀與基因芯片聯(lián)用（ ChIP on Chip），系統(tǒng)化地研究 N 端三甲基化的 組蛋白 H3 的染色質(zhì)附著位點(diǎn)在肝細(xì)胞分化不同階段的變化； B）選取具有代表性的附著位點(diǎn)，研究肝細(xì)胞分化不同階段在附著位點(diǎn)附近基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，對于轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化的基因深入研究其在肝細(xì)胞分化過程中的功能及作用機(jī)制。 4） 肝細(xì)胞 特異 性 組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶在肝細(xì)胞形成與分化中的作用與分子機(jī) 理 。 A） 在斑馬魚胚胎和 胚胎干細(xì)胞體系 中，抑制或過表達(dá)肝細(xì)胞特異的組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶， 通過檢測肝臟不同發(fā)育時(shí)期的分子標(biāo)記研究其在肝細(xì)胞分化 及肝臟發(fā)育 中的 功能； B）利用 ChIP on Chip，研究肝細(xì)胞特異性組蛋白 H3 N 端三甲基化酶功能缺失后，三甲基化 組蛋白 H3 在染色質(zhì)上附著位點(diǎn)的變化，以及對代表性位點(diǎn)附近基因轉(zhuǎn)錄的影響，對于轉(zhuǎn)錄受影響的基因深入研究其介導(dǎo)表觀遺傳調(diào)控肝細(xì)胞分化的分子機(jī)理。 6. 表觀遺傳在 斑馬魚 內(nèi)胚層器官發(fā)育的不同階段的穩(wěn)定性及其功能的系統(tǒng)研究。 1） 在 斑馬魚 內(nèi)胚層器官發(fā)育的不同階段 對 H3K4Me H3K27Me H3K9/18Ac、H4K12Ac 的表觀遺傳穩(wěn)定性及功能 的系統(tǒng) 化 研究 。 A）建立斑馬魚全基因組基因芯片； B）利用 sox17:GFP 或 gutGFP 轉(zhuǎn)基因魚中內(nèi)胚層細(xì)胞所攜帶的綠色熒光，在不同發(fā)育時(shí)期的斑馬魚胚胎中通過 FACS 技術(shù)分選內(nèi)胚層細(xì)胞并制備勻漿； C）利用 H3K4Me H3K27Me H3K9/18Ac、 H4K12Ac 抗體及斑馬魚全基因組基因芯片在各時(shí)期的胚胎勻漿中進(jìn)行 ChIP on Chip，系統(tǒng)地闡明不同修飾的組蛋白在內(nèi)胚層 器官發(fā)育不同時(shí)期的全基因組中分布 12 變化。 2） 選取 具有代表性的 表觀遺傳 位點(diǎn)，研究染色質(zhì) 上相應(yīng)位點(diǎn) 附近基因 在調(diào)控 內(nèi)胚層器官 發(fā)育 中的 功能 及分子機(jī)理 。 A）研究組蛋白修飾酶的特異性化學(xué)抑制劑如曲古霉素 A（ TSA）對基因表達(dá)水平和內(nèi)胚層器官發(fā)育的影響； B）在基因組中選取在不同發(fā)育階段表觀遺傳穩(wěn)定發(fā)生變化的修飾后組蛋白附著位點(diǎn)，研究其附近基因在內(nèi)胚層中轉(zhuǎn)錄水平在不同發(fā)育時(shí)期的變化，以及該基因是否對于 TSA 等對內(nèi)胚層器官發(fā)育的影響具有回救（ rescue）效應(yīng)；C）對于內(nèi)胚層中轉(zhuǎn)錄水平在不同發(fā)育時(shí)期發(fā)生變化的基因，我們將研究其在 內(nèi)胚層發(fā)育過程中的功能及分子機(jī)理。 7. 具有 肝臟 發(fā)育 缺陷的斑馬魚突變體及致變基因的功能機(jī)制 研究。 1） 具有 肝臟 發(fā)育缺陷突變體的表現(xiàn)型 研究。通過檢測內(nèi)胚層及肝臟發(fā)育不同時(shí)期的分子標(biāo)記，研究突變體所具有的肝臟發(fā)育缺陷表現(xiàn)型。 2） 導(dǎo)致 肝臟 發(fā)育缺陷的致變基因 克隆及其調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理研究 。 A）同 全基因組 多型性標(biāo)記（ polymorphic marker） 掃描 、 細(xì)菌人工染色體（ bacterial artificial chromosome， BAC）克隆 重疊群（ contig） 的建立、零重組多型性標(biāo)記的獲得、候選致變基因的測序 等過程定位和克隆致變 基因 ； B）利用 特異性的 morpholino 和 mRNA 回救以 確 證致變 基因 ，研究其表達(dá)模式；C） 運(yùn)用細(xì)胞移植 技術(shù) 研究 致變 基因 調(diào)控肝臟 發(fā)育 功能的 細(xì)胞自主（ autonomous） 或 非自主（ nonautonomous） 性 ，如果是非自主的 ，確定調(diào)控肝臟 發(fā)育 的致變基因表達(dá)組織； D） 采用酵母雙雜交、 抗體制備、免疫 共沉淀 、染色質(zhì)免疫共沉淀 等方法深入研究該基因調(diào)控 肝臟 發(fā)育的分子機(jī) 理 。 8. NEMO/IKK?及其 K63 多泛素化在調(diào)控肝臟發(fā)育中的功能與分子機(jī)理。 1） NEMO/IKK?及其多泛素化在調(diào)控斑馬魚肝臟發(fā) 育中的功能。 A）研究NEMO/IKK?、 NFκB 亞基 p65 和 p50 敲降及內(nèi)胚層特異性敲降后肝臟分子標(biāo)記表達(dá)的變化； B）制備斑馬魚 NEMO/IKK?抗體，在不同時(shí)期分離 gutGFP 13 斑馬魚胚胎的肝臟區(qū)域細(xì)胞并制備細(xì)胞勻漿，通過 NEMO/IKK?抗體進(jìn)行免疫共沉淀后利用泛素抗體檢測 NEMO/IKK?的泛素化水平及其在不同發(fā)育時(shí)期的變化。 2） NEMO/IKK?多泛素化酶的確定及其在肝臟發(fā)育中的功能。 A） 生化分析DrUbc1 DrUev、 DrTraf6 與 NEMO/IKK?之間的相互作用 ； B）潛在的多泛素化蛋白敲降后 ，檢測肝臟中 NEMO/IKK?的泛素化水平的變化； C）研究導(dǎo)致 NEMO/IKK?泛素化水平發(fā)生變化的 K63多泛素化蛋白過表達(dá)或敲降后，對胚胎細(xì)胞核中具有活性的磷酸化 NFκB 水平以及對肝臟發(fā)育的影響；D）研究 NEMO/IKK?敲降后， K63 泛素化蛋白過表達(dá)或敲降對肝臟發(fā)育的影響，以確證 K63 多泛素化蛋白是通過 NEMO/IKK?來發(fā)揮功能的； E）建立轉(zhuǎn)基因魚，在不同發(fā)育時(shí)期誘導(dǎo) K63 多泛素化蛋白過量表達(dá)，研究其對肝臟發(fā)育和 NEMO/IKK?泛素化水平的影響。 9. Wnt 信號途徑及其 上游 調(diào)控因子 KLP 在斑馬魚肝臟 發(fā)育中的功能機(jī)制。 1) Wnt 信號途徑調(diào)控 肝臟發(fā)育的分子機(jī)理 。 A）利用 hsp:dkk1GFP 轉(zhuǎn)基因系，在 胚胎發(fā)育的不同時(shí)期抑制 Wnt 通路， 分析肝 臟分子標(biāo)記 表達(dá) 的 變化 ； B）利用 全胚胎 原位雜交 和 Realtime PCR 等 ，獲得斑馬魚 Wnt 信號 途徑 分子表達(dá)的完整信息，確定不同發(fā)育時(shí)期參與 Wnt 途徑 激活的 潛在 信號分子 ，深入研究這些信號分子在肝 臟發(fā)育 中的 功能 與機(jī)制。 2) KLP 調(diào)控肝 臟發(fā)育 的分子機(jī)理 。 KLP 是我們在最近工作中發(fā)現(xiàn)的 Wnt 信號途徑上游調(diào)控因子。 A） 研究 KLP 敲降 或過表達(dá) 導(dǎo)致的 肝 臟 發(fā)育 表現(xiàn)型及肝 臟分子標(biāo)記表達(dá) 的變化； B）通過 Wnt 信號分子對 KLP 功能異常所導(dǎo)致的肝臟表現(xiàn)型的回救、 Wnt信號途徑被抑制或 Wnt信號分子功能缺失后 KLP功能異常所導(dǎo)致的肝臟表現(xiàn)型和分子標(biāo)記表達(dá)的變化等， 探討 KLP通過 Wnt信號途徑 調(diào)控肝 臟發(fā)育 的作用機(jī)制。 C）在胚胎干細(xì)胞體外分化體系中，研究 KLP 過表達(dá)或抑制對肝細(xì)胞分化的影響。 14 課題二：調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機(jī)理研究 1. 在 斑馬魚 預(yù)定的 胰內(nèi)外分泌 前體細(xì)胞中 差 異表達(dá)基因 的 篩選及其功能機(jī)制研究。 1） 斑馬魚 原腸中后期 內(nèi)胚層細(xì)胞 、 4－ 6 體節(jié)時(shí)期 預(yù)定的 內(nèi)、外分泌 前體細(xì)胞及 非預(yù)定 的胰腺 前體細(xì)胞的分選， 四 者 差異表達(dá)基因的芯片篩選。 A）在 4－ 6 體節(jié)時(shí)期的 sox17:Kaede 或 sox17:Dendra 胚胎中定點(diǎn)激活單一類型的胰腺預(yù)定前體細(xì)胞，然后立即利用 FACS 技術(shù)分選紅色熒光細(xì)胞； B）細(xì)胞分選后立即提取總 RNA 并制備芯片探針，通過基因芯片分析獲得并確證胰內(nèi)、外分泌腺兩種預(yù)定的前體細(xì)胞相互之間及其分別與原腸中末期內(nèi)胚層細(xì)胞和非胰腺前體細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因。 2） 差異表達(dá)基因的表達(dá)模式、功能和作用機(jī)制研究。 A）在差異表達(dá)基因克隆并經(jīng)定量 PCR 確證后，首先將研究基因的表達(dá)模式，力爭獲得 10 體節(jié)以前預(yù)定的胰內(nèi)、外分泌腺 前體細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記； B）研究 mRNA 過表達(dá)、morpholino 敲降、內(nèi)胚層特異性 morpholino 敲降后的胚胎表現(xiàn)型及其對胰腺不同發(fā)育時(shí)期的分子標(biāo)記表達(dá)的