微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法-文庫(kù)吧
2024-12-29 23:11 本頁(yè)面
【正文】 析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來(lái)，然后用氣相色譜分析，得出 PLFA譜圖。 4. ERIC (腸桿菌基因間保守重復(fù)序列 ) PCR指紋圖譜技術(shù) ? Di Giovanni 等用 ERICPCR分析 6種純菌組成的混合菌的組成，獲得了高重復(fù)性的指紋圖譜，比常規(guī)RAPDPCR相比更能反映菌群的組成特征。 ? 在微生物群落中，各細(xì)菌數(shù)量占 110%時(shí)，其特征性ERICPCR主條帶就可以在指紋圖中表現(xiàn)出來(lái)。 ERICPCR指紋圖中，每一條帶可以是來(lái)自若干種不同微生物的基因組 DNA片段，條帶的數(shù)目反映微生物類群的多少，條帶的亮度反映該類群微生物種群數(shù)量的高低。 ? 分析不同環(huán)境樣品中微生物混合 DNA的 ERICPCR指紋圖譜的差異，就可比較不同生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的差異，或者同一個(gè)群落在不同功能狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)變化。 E1: 539。ATgTAAgCTCCTggggATTCAC339。 E2: 539。AAgTAAgTgACTggggTgAgCg339。 ERICPCR引物 20 pmol/μl 5. 以 PCR為基礎(chǔ)的 rRNA及 rDNA的分析方法 ? 用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析的基因組 DNA的序列包括：核糖體操縱子基因序列 (rDNA)、已知功能基因的序列、重復(fù)序列和隨機(jī)基因組序列等。 ? 最常用的標(biāo)記序列是核糖體操縱子基因 (rDNA)。rRNA(rDNA)在細(xì)胞中相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類的一個(gè)重要指標(biāo)。 Diversity estimation based on molecular markers 實(shí)驗(yàn)原理 ? 16S rDNA是基因組的“ biomarker‖ ? – 核糖體 RNA是蛋白質(zhì)合成必需的， 16S rDNA廣泛存在于所有原核生物的基因組中。 ? – 16S rDNA的序列中包括保守區(qū)和可變區(qū)。 ? – 序列變化比較緩慢，與物種的形成速度相適應(yīng)，而且一般不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。 ? – GeneBank和 RDPⅡ （ Ribosomal DatabaseProject ）數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登錄了超過(guò) 97,128個(gè)經(jīng)過(guò)比對(duì)和注釋的 16S rDNA序列，可供進(jìn)行比對(duì)。 16S ribosomal RNA ? Present in all life ? molecular chronometer – taxonomy (large database) – evolution ? one active bacterial cell: – ~ 104 copies – ~ 15 rRNA genes (., rDNA) (Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Sulfolobus solfataricus with 1 copy, Clostridium paradoxum with 15 copies) ? ~1500 nt (enough information) – four different domains – conserved regions (no variation among all life) – variable regions (V1V9) Source: Louis, B., Gene IV, 1997 環(huán)境 16S rDNA文庫(kù)的構(gòu)建與組成分析技術(shù) ? 1990年， Giovannoni等首先用這一方法分析馬尾藻海海面上浮游微生物的多樣性。 ? 16S rDNA文庫(kù)中的藍(lán)藻種類與培養(yǎng)出來(lái)的藍(lán)藻很不一致； ? 發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的且在該環(huán)境中占優(yōu)勢(shì)的微生物類群； ? 與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法相比，更全面得揭示了微生物多樣性； ? 這一方法目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用于土壤、海洋、湖泊、腸道等多種生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性的調(diào)查，揭示了環(huán)境當(dāng)中前所未知的微生物的多樣性。 構(gòu)建環(huán)境 16S rDNA文庫(kù)的方法 ? 用環(huán)境基因組總 DNA進(jìn)行 16S rDNA PCR擴(kuò)增：把環(huán)境中幾乎所有微生物基因組上的 16S rDNA擴(kuò)增并收集到一起。 ? universal primers: 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’ (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5’TACCTTGTTACGACTT3’ ( bases 1507 to 1492) ? ―TA克隆”：把每一個(gè) 16S rDNA分子放到文庫(kù)中的每一個(gè)克隆里。 陽(yáng)性克隆篩選的過(guò)程： ? ，挑選出含有質(zhì)粒的克隆 ? ，挑出帶有插入片段的克隆 ? ，挑出帶有正確長(zhǎng)度插入片段的克隆
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