cr引物設(shè)計(jì)及相關(guān)軟件使用-文庫吧
2024-12-28 07:49 本頁面
【正文】 rpin）的能值 ?在錯(cuò)配位點(diǎn)（ false priming site）的引發(fā)效率 ?引物及產(chǎn)物的 GC 含量（ position），等等。 ?必要時(shí)還需對引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。 一般原則 1. 引物的長度一般為 1530 bp，常用的是 1827 bp，但不應(yīng)大于 38，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于 74℃ ，不適于 Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。 2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是 3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物 3’端出現(xiàn) 3 個(gè)以上的連續(xù)堿基，如 GGG 或CCC，也會使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。 一般原則 3’端的末位堿基對 Taq 酶的 DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為 A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他 3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的 3’端使用堿基 A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致 PCR 反應(yīng)失敗。 5’端序列對 PCR 影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。 一般原則 4. 引物序列的 GC 含量一般為 4060%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所對應(yīng)模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使復(fù)性條件最佳。 Tm 值的計(jì)算有多種方法，如按公式 Tm＝ 4(G+C)＋ 2(A+T)，在 Oligo 軟件中使用的是最鄰近法 (the nearest neighbor method) 。 一般原則 6. ?G 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用 3’端 ?G 值較低（絕對值不超過 9），而 5’端和中
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