【正文】 相似性較高，尤其是 3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。應(yīng)當(dāng)選用 3’端 ?G 值較低（絕對值不超過 9），而 5’端和中間 ?G 值相對較高的引物。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為 A 的錯配效率明顯高于其他 3 個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的 3’端使用堿基 A。 PCR ?引物設(shè)計(jì)是 PCR 技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。 5. 引物所對應(yīng)模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使復(fù)性條件最佳。 一般原則 4. 引物序列的 GC 含量一般為 4060%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。PCR引物設(shè)計(jì)及相關(guān)軟件使用 重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 楊應(yīng)斌 主要內(nèi)容 ?背景 ?PCR引物設(shè)計(jì)原則 ?常用 PCR引物設(shè)計(jì)軟件 ?Primer Premier 介紹 ?Oligo 介紹 ?在線 Primer3 介紹 PCR 聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 5’端序列對 PCR 影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。 Tm 值的計(jì)算有多種方法，如按公式 Tm＝ 4(G+C)＋ 2(A+T)，在 Oligo 軟件中使用的是最鄰近法 (the nearest neighbor method) 。使用不合適的 PCR 引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。 一般原則 3’端的末位堿基對 Taq 酶的 DNA 合成效率有較大的影響。引物的 3’端的 ?G 值過