【正文】 ， 4， 5mL，分別置 10mL 容量瓶中，加入 5%亞硝酸鈉溶液 ，振蕩搖勻，放置 6min；再加入 10%硝酸鋁 ，振蕩搖勻，放置 6min；最后加入 4%氫氧化鈉試液 4mL，加甲醇定容至刻度，搖勻，放置 15min。采用分光光度法，在 510nm處測定吸光度，以對照品量（ mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。 微波提取單因素實驗方法 分別考察不同的微波輻 射功率 ,輻射時間 ,乙醇濃度 ,固液比對提取效果的影響 提取工藝正交試驗設(shè)計方法 系統(tǒng)考察微波提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)已有的資料及實際情況，選用微波輻射功率（ A），輻射 時間（ B），乙醇濃度（ C），固液比（ D）作為考察因素，以測得的浸提取樣品中總黃酮含量為考察指標，選用 L9（ 34）正交表設(shè)計 ，得到供試液。 微波輔助提取法與乙醇回流法比較 比較兩種提取方法的處理時間和液固比對總黃酮提取量的影響。傳統(tǒng)乙醇回流法提取總黃酮的所需時間比微波輔助提取法提取長得多，且金銀花總黃酮提取量比較低 。而微波輔助提 取的總黃酮較乙醇回流法高。比較此兩種方法在最佳條件下的總黃酮含量。 總黃酮含量測定方法 取 液，加入 5%亞硝酸溶液 蕩搖勻，放置 6min 加入 10%硝酸鋁 蕩搖勻，放置 6min 入 4%氫氧化鈉試液 4mL， 30%（ V/V）乙醇定容至刻度，搖勻，放置 15min 分光光度法，在 510nm定吸光度值由標準曲線計算得總黃酮含量。 4. 結(jié)果 標準曲線繪制 表 41 標準曲線表 編號 0 1 2 3 4 5 10 蘆丁濃 度（ mg/mL） 0 吸光度（ OD） 0 圖 41 標準曲線圖 以 蘆丁濃度（ mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到回歸方程為：Y=+， R2=， 表明在一定范圍內(nèi)線形關(guān)系良好。 微波提取金銀花總黃酮單因素實驗方法 微波功率對金銀花總黃酮提取的影響 準確稱取 5g金銀花粉末，加入 70%的乙醇溶液，設(shè)定微波功率為 126W700W，微波輔助提取全程時間為 10min，將提取液離心，取上清液，將過濾渣乙醇回流 2h后合并提取液，檢測總黃酮含量， 實驗結(jié)果見圖 42 和表 42。 表 42 微波功率對金銀花總黃酮提取的影響 微波功率（ W） 126 252 406 567 700 總黃酮得率（ %） 11 01230 200 400 600 800微波功率（W)總黃酮含量（%） 圖 42 微波功率對金銀花總黃酮提取的影響 由圖 42可知，微波功率設(shè)在 300W~800W之間，隨著微波功率的增大，微波對細胞壁的破碎作用增強，胞內(nèi)總黃酮溶出速率增 大，得率逐漸增高。 微波處理時間對金銀花總黃酮提取的影響 準確稱取 5g金銀花粉末，加入適量 70%的乙醇溶液，設(shè)定微波功率為 406W，微波輔助提取時間分別設(shè)定為 4min， 6min， 8min， 10min， 12min， 14min 將提取液離心，取上清液，將過濾渣乙醇回流 2h 后合并提取液，檢測總黃酮含量，實驗結(jié)果見圖 42 和表 42。 表 43 微波處理時間對金銀花總黃酮提取的影響 微波時間（ min） 4 6 8 10 12 總黃酮得率（ %） 圖 43 微波處理時間對金銀花總黃酮提取的影響 12 由圖 43可見，微波時間在 10min內(nèi)，黃酮含量隨著超聲時間的延長而增加，10min時達到最大值。 固液比對金銀花總黃酮提取的影響 準確稱取 5g金銀花粉末，液固比分別設(shè)定為 20， 30， 40， 50， 60 將提取液離心，取上清液，將過濾渣乙醇回流 2h后合并提取液，實驗結(jié)果見圖 44 表 44。 表 44 固液比對金銀花總黃酮提取的影響 固液比 （ mL/g） 20 30 40 50 60 總黃酮得率（ %） 圖 44 固液比對金銀花總黃酮提取的影響 由圖 44 可知，在液固比為 1:30 的時候有一個峰值，液固比在 20 到 30 時候隨液固比的升高，含量增加， 1:40 到 1:60 的時候，隨液固比的增加，含量減少。液固比在 1:30 的時候總黃酮含量最高，達到 %。 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取的影響 準確稱取 5g金銀花粉末，加入適量 70%的，設(shè)定微波功率為 406W，微波輔助提取液固比設(shè)定為 30,分別設(shè)定乙醇溶液溶度為 50%， 60%， 70%， 80%， 90%將提取液離 心，取上清液，將過濾渣乙醇回流 2 小時后合并提取液，檢測總黃酮含量 , 實驗結(jié)果見圖 表 . 0120 10 20 30 40 50 60 固液比(mL/g)總黃酮得率(%) 13 表 45 乙醇濃度對金銀花總黃酮提取的影響 乙醇濃度（ %） 50 60 70 80 90 總黃酮得率（ %） 圖 45 乙 醇濃度對金銀花總黃酮提取的影響 從上圖可見，金銀花 總黃酮 最佳提取乙醇濃度為 70%，而在乙醇濃度過高或過低時得率較小?？赡艿脑蚴牵阂掖紳舛冗^低，提取液中雜質(zhì)含量較多，可能是蛋白質(zhì)、過濾、濃縮、和分離均較困難 。而 隨著乙醇濃度的提高，脂溶性的物質(zhì)溶出增多，給提純帶來較大的麻煩。所以，選擇 70%乙醇作為微波輔助提取溶劑。 微波輔助提取金銀花總黃酮正交實驗方法 為系統(tǒng)考察微波提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)單因素實驗，分別選擇乙醇濃度 %（ A） 、 固液比（ B） 、 微波功率 W（ C）和微波時間 min（ D）作為考察因素，以測得的浸提取樣品中總黃酮含量為考察指標，選用擇 L9（ 34）正交表設(shè)計得到供試液 正交設(shè)計表見 46，實驗結(jié)果見表 47。 表 46 正交實驗因素水平表 實驗號 乙醇濃度 %（ A） 固液比（ B） 微波功率 W（ C） 微波時間 min（ D） 1 50 1:25 252 8 2 70 1:30 406 10 3 90 1:35 700 12 012340 50 60 70 80 90 乙醇濃度（%）總黃酮得率(%) 14 表 47 微波輔助提取金銀花總黃酮 的 L9（ 34）正交試驗結(jié)果 表 因素 乙醇濃度（ %） 固液比（ g/mL） 微波功率 （ w） 微波時間 （ min） 黃酮得率（ %） 試驗號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M1 M2 M3 m1 m2 m3 R A 50 50 50 70 70 70 90 90 90 B 1:25 1:30 1:35 1:25 1:30 1:35 1:25 1:30 1:35 C 252 406 700 406 700 252 700 252 406 D 8 10 12 12 8 10 10 12 8 為進一步確定各因素對 金銀花總黃酮得 率的影響程度，對表 47 中的 各因素 進行方差分析和顯著性檢查，見表 48。 表 48 方差分析表 方差來源 離差平方和 自由度 均方 F 值 顯著性 A B C D 2 2 2 2 * * * 由上表可知：微波時間 min（ D）對提取率的影響很小，作為誤差項。顯著性檢驗后發(fā)現(xiàn)因素：固液比（ B） 、 乙醇濃度 %（ A）和微波功 率 W（ C）對指標影響 15 顯著。根據(jù)以上分析，可定出影響指標的因素顯著性主次順序為： ACBD?？傸S酮的優(yōu)選浸提條件（各因子優(yōu)水平組合）為 最佳提取功率為 406W，最佳提取時間為12min，最佳固液比 1:25，最佳乙醇濃度為 70%。該工藝條件下金銀花總黃酮粗品得率可以達到 %。 乙醇回流法提取總黃酮 乙醇回流時間對金銀花總黃酮提取的影響 準確稱取發(fā)酵液 150mL，用水提法浸提 1， 2， 3， 4， 5h后，測定總黃酮的含量，結(jié)果見圖 46表 49。 表 49 乙醇回流法處理時間對金銀花總黃酮提取的影 響 處理時間（ h） 1 2 3 4 5 6 總黃酮得率（ %） 圖 46 乙醇回流時間對金銀花總黃酮提取的影響 圖 46 回 流時間對金銀花總黃酮提取的影響 由圖 46 知，用乙醇回流法提取金銀花總黃酮，隨時間的變長，總黃酮的提取量也在增加，提取 5h時，總黃酮含量最高。 回流固液比對金銀花總黃酮提取的影響 用傳統(tǒng)乙醇回流法提取金銀花總黃酮，在其他條件不變的情況下，改變回流 液固比 ，測得的金銀花總黃酮含量見表 410 和圖 47。 表 410 回 流液固比金銀花總黃酮提取的影響 液固比（ mL/g） 20 30 40 50 60 總黃酮得率（ %） 16 圖 47 回 流固液比對金銀花總黃酮提取的影響 由圖 47 知，乙醇回流法提取金銀花總黃酮的時候，總黃酮的含量隨著固液比的升高而升高，液固比在 50 到最高得率為 %。當液固比超過 50 的時候，金銀花總黃酮的含量隨固液比的增加而減少。所以乙醇回流法提取金銀花總黃酮的最佳 液固比是 50:1。 由圖 43 和圖 46明 顯可看出兩種提取方法總黃酮提取量隨時間的延長而提高，但傳統(tǒng)乙醇回流法提取總黃酮的所需時間比微波輔助提取法提取長得多，且金銀花總黃酮提取量比較低，而微波輔助提取的總黃酮較乙醇回流法高。 由圖 44 和 47 知，在相同液固比下，微波輔助提取的總黃酮較乙醇回流法高。 微波輔助與傳統(tǒng)提法最佳工藝對比 比較此兩種方法在最佳條件下的總黃酮得率，結(jié)果見表 411。 表 411 微波輔助與傳統(tǒng)提法最佳工藝對比表 提取方法 時間 固液比 功率 乙醇濃度 總黃酮得率 微波輔助提取法 10min 1:25 406W 70% % 乙醇回流法 5h 1:50 ／ 70% % 從表可知，在兩種方法的最佳工藝條件下，微波輔助提取法提取得到的總黃酮明顯要高于傳統(tǒng)乙醇回流法，且浸提劑用量少，提取時間縮短 ,提取量增加，提取過程無需高溫，避免了因高溫對總黃酮分子結(jié)構(gòu)的破壞，被浸提的生物活性物質(zhì)在短時間內(nèi)保持不變，是黃酮化合物工業(yè)生產(chǎn)較理想的一種提取新工藝。 微波輔助提取金銀花黃酮類化合物提取率能達到 %，要高于乙醇回流法提取的 %。微波輔助提取時間僅為 10min，比乙醇回流法提取的 5h要遠遠的縮短了。 010 20 40 60 80 固液 比(mL/g)總黃酮得率(%) 17 5. 討論 微波萃取法的原理是微波直接與被分離物作用，微波的激活作用導致樣品基體內(nèi)不同成分的反應(yīng)差異使被萃取物與基體快速分離，通過偶極子旋轉(zhuǎn)和離子傳導兩種方式同時加熱，加劇了體系中分子的碰撞頻率，使黃酮分子容易從藥材內(nèi)部擴散到溶劑中，大大縮短加熱的時間，并達到較高產(chǎn)率 。 傳統(tǒng)的工藝需要以熱傳導、熱輻射等方式進行，溫度上升緩慢，提取時間長。本實驗中，用傳統(tǒng)醇回流法需要大于 4 h的提取過程，而微波萃取法只需 30 min即可完成，提取率較傳統(tǒng)醇提取法高，節(jié)時，節(jié)能，其優(yōu)越性顯而易見。 6. 小結(jié) 本實驗采用單因素分組實驗方法，在此基礎(chǔ)上進行正交試驗 設(shè)計，結(jié)合實際情況分別確定了微波輔助提取法和傳統(tǒng)乙醇回流提取法提取金銀花總黃酮的最佳工藝。其中傳統(tǒng)乙醇回流提取法的最佳工藝條件為液固比 50:1，提取時間 5h；金銀花總黃酮微波輔助提取工藝，最佳提取功率為 406W，最佳提取時間為 12min，最佳液固比 25:1，最佳乙醇濃度為 70%。該工藝條件下金銀花總黃酮粗品得率可以達到%。 本方法與其他方法比較 微波輔助提取法與傳統(tǒng)水提法相比，提取時間縮短至二十四分之一，所得凈多糖產(chǎn)率也有一定