《cr的種類及應用》ppt課件-文庫吧
2024-12-24 00:23 本頁面
【正文】 ) 或過低 (22℃) 都可影響 Taq DNA聚合酶的活性，該酶雖然在90℃ 以上幾乎無 DNA合成， 但確有良好的熱穩(wěn)定性，在 PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性 . Taq DNA聚合酶 2022/2/3 7 PCR（ Polymerase Chain Reaction） 即聚合酶鏈式反應，是一種在體外快速擴增特定基因或 DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增。 它可以在試管里建立反應，經(jīng)過數(shù)小時之后，就能將極微量的目的基因或者某一特定的 DNA片段擴增數(shù)十萬倍，乃至千百萬倍，而無需通過繁瑣費時的基因克隆程序，便可獲得足夠數(shù)量的精確的 DNA拷貝，所以有人亦稱為無細胞的分子克隆法。 PCR的定義 PCR 操作過程 預變性（ Initial denaturation）． 模板 DNA完全變性對 PCR能否成功至關重要，一般 95℃ 加熱 35分鐘。 引物退火（ Primer annealing） 退火溫度一般需要憑實驗（經(jīng)驗）決定。 退火溫度對 PCR的特異性有較大影響。 引物延伸 引物延伸一般在 72℃ 進行（ Taq酶最適溫度）。 延伸時間隨擴增片段長短而定。 循環(huán)中的變性步驟 循環(huán)中一般 95℃ ， 30秒足以使各種靶 DNA序列完全變性： 變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。 循環(huán)數(shù) 大多數(shù) PCR含 2535循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特燉條帶 最后延伸 在最后一個循環(huán)后，反應在 72℃ 維持 515分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。 引物設計 設計引物可以采取以下原則： ? GC所占比例為 40％－ 60％ ? 兩個引物的 Tm， 相差小于 5℃ ，并且擴增產(chǎn)物的 Tm與引物的相差不超過 10℃ 。 ? 黏合溫度通常比計算的最低 Tm低 5℃ ，但是要根據(jù)經(jīng)驗為不同條件下的PCR選擇不同的黏合溫度。 ? 內(nèi)部的具有自身互補性的發(fā)卡結(jié)構(gòu)不超過 4個，其二聚體中不超過 8個。 ? 3‘末端尤其重要，必須不含有與其他引物互補的序列，并且要與模板完全互補。倒數(shù)第二個最好是 G/C PCR的各種變體 ? 反向 PCR (Inverse PCR, IPCR) ? 不對稱 PCR (asymmetric PCR) ? 多重 PCR ? 熒光定量 PCR（ QPCR) ? 反轉(zhuǎn)錄 PCR (reverse transcription,RT PCR) ? 巢式 PCR (NEST PCR) ? 遞減 PCR(Touchdown PCR) 2022/2/3 10 ? 原理： 擴增引物相反方向 DNA 序列的技術 。用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī) PCR擴增的是已知序列的兩引物之間 DNA片段 .實驗時選擇已知序列內(nèi)部沒有切點的限制性內(nèi)切酶對該段 DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進行 PCR，其擴增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究 . 2022/2/3 11 已知序列 未知序列 反向 PCR (Inverse PCR, IPCR) 1. 用一種在靶序列上沒有切點的限制性內(nèi)切酶 消化大分子量的 DNA 2. 產(chǎn)生的大小不同的線性DNA片段群體，其中具靶 DNA區(qū)段的 DNA
教學課件相關推薦
鄂ICP備17016276號-1