《elisa實(shí)驗(yàn)》ppt課件-文庫吧
2025-12-08 14:07 本頁面
【正文】 ，以捕獲血清標(biāo)本中的 IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的 IgM）。 此法常用于病毒性感染的早期診斷。 雙抗夾心法測抗體 3. ELISA的試劑 (A、 B、 C三部分 ) ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。 （ 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （ 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； （ 3）酶的底物； （ 4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品； （ 5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （ 6）洗滌液； （ 7）酶反應(yīng)終止液 ELISA的試劑準(zhǔn)備 A 固相載體 聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的 ELISA板應(yīng)該是 吸附性能好 ， 空白值低 ， 孔底透明度高 ，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間 性能相近 。 包被的方式 將抗原或抗體固定在固相載體的過程稱為包被 (coating)。 蛋白質(zhì) 與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的 疏水基團(tuán) ，故更易吸附到固相載體表面。 不易吸附 的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。 親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的 DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。 脂類物質(zhì) 無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可伲瑑H為直接包被的 1/10乃至于 /100。 包被用抗原： 天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。 合成多肽抗原 是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。 包被用抗體 IgG對聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在 Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。 取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液 .須除去雜抗體后才能用于 ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。 腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。 包被的條件 pH78的 TrisHCL緩沖液。 加入包被液后，在 48℃ 冰箱中放置過夜， 37℃ 中保溫 2小時。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為 10ng/ml20ug/ml。 封閉 封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥 ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑： %%的 BSA。 10%的小牛血清或 1%明膠。脫脂奶粉 ,比較價廉，可以高濃度使用（ 5%）。 所有的 ELISA固相均需封閉？ 洗滌液 在板式 ELISA中，常用的稀釋液為含 %吐溫 20磷酸鹽緩沖液。 ELISA的試劑準(zhǔn)備 B 結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是 ELISA中關(guān)鍵的試劑 1 酶的催化活性 2抗體（或抗原）的免疫活性
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