【正文】 (kJ/g)； 消化能量攝入 (kJ/d) =總能量攝入 – [糞便干質(zhì)量 (g/d) 糞便的總能量含量 (kJ/g)]； 消化率 (%) =消化能量攝入 /總能量攝入 100% 氧化應(yīng)激標(biāo)記物和抗氧化酶 實(shí)驗(yàn)材料的提取，采用斷頸法取血，將黑線倉鼠處死，快速取其肩胛間的褐色脂肪組織溫州大學(xué)本科畢業(yè)論文 溫度對(duì)黑線倉鼠抗氧化能力和解偶聯(lián)蛋白表達(dá)的影響 4 （ BAT），腿部骨骼肌、肝臟、心臟和大腦，并且將這些實(shí)驗(yàn)材料儲(chǔ)在液態(tài)氮中迅速冷凍，以保證實(shí)驗(yàn)材料的活性。組織的處理方式：按照一定的質(zhì)量配 比將組織放置到冰冷的 %的氯化鈉溶液中進(jìn)行勻漿，然后再放到離心機(jī)中用 3000 轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速對(duì)其進(jìn)行離心， 15 分鐘后取其上清液保存在適宜的環(huán)境中待后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。用 Lowry 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 。 使用 (南京建成生物工程研究所 )生產(chǎn)的試劑測(cè)定 過氧化氫（ H2O2）水平， 并通過對(duì)過氧化氫水平的測(cè)定來分析分析黑線倉鼠的氧化應(yīng)激水平。過氧化氫（ 405nm）的水平表示為毫摩爾 /克蛋白質(zhì)（ mmol/g protein）。 丙二醛 (MDA)作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的指標(biāo)。 MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，用硫代巴比妥酸（ TBA）在 532nm 波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，并且產(chǎn)生具有粉紅色的產(chǎn)物。組織 MDA 水平表示為納摩爾 /克蛋白質(zhì)（ nmol/mg protein）。 總抗氧化能力（ TAOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（ GSHPX）活性 使用 (南京建成生物工程研究所 )生產(chǎn)的試劑測(cè)定 TAOC 和 GSH活性。 在之前的大量預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)這些試劑都適用于黑線倉鼠。黑線倉鼠機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使 3價(jià)的 Fe 還原成 2 價(jià)的 Fe，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)和物，通過比色可測(cè)出其抗氧化能力的高低。在測(cè)定過程中，將待測(cè)液按一定要求處理后用雙蒸水調(diào)零 1cm 光徑， 520nm測(cè)各種管吸光度。定義：在 37℃時(shí)，每分鐘每毫克待測(cè)液，使反應(yīng)體系的吸光度 (OD)值每增加 時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。 在 GSHPX 活性測(cè)定的基礎(chǔ)上還原谷胱甘肽（ GSH），過氧化氫產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（ GSSG）和 H2O 反應(yīng)。 GSH 與二硫化碳代 2 硝基苯甲酸（ DTNB）反應(yīng)產(chǎn)生 2硝基 5硫代苯甲酸，可以在 412nm 處被檢測(cè)的黃色化合物反應(yīng)。 實(shí)時(shí) RTqPCR 的分析 熒光定量 PCR 分析使用 Trizol 試劑（ TAKARA，中國(guó)大連）。提取褐色脂肪組織、肝、心臟、骨骼肌和腦組織總 RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度值確定 RNA 樣品濃度，然后調(diào)節(jié)到一致水平。取用調(diào)整過濃度的總 RNA 樣品 2μL，用 MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（ TAKARA）和 oligo（ dT18）引物進(jìn)行 cDNA 的合成，反應(yīng)體系為 50μL。用 2μL的 cDNA 樣品作為模板，使用解偶聯(lián)蛋白目的基因的特定引物進(jìn)行 PCR 反應(yīng)（ 表 1）。 溫州大學(xué)本科畢業(yè)論文 溫度對(duì)黑線倉鼠抗氧化能力和解偶聯(lián)蛋白表達(dá)的影響 5 表 1：用基因特異性引物序列測(cè)定實(shí)時(shí) RTQPCR 來分析解偶聯(lián)蛋白在黑線倉鼠中的表達(dá)。 Table 1. Genespecific primer sequences used for Realtime RTQPCR analysis of uncoupling protein (UCP) expression in the striped hamster. Gene Primers (5’to 3’) Size (bp) UCP1 (forward) GGGACCATCACCACCCTGGCAAAAA 330 UCP1 (reverse) GGCTTTCTGTTGTGGCTAT UCP2 (forward) GCTGGCGGTGGTAGGAGAT 208 UCP2 (reverse) TGAAGTGGCAAGGGAGGT UCP3 (forward) ATGGATGCCTACAGAACC 90 UCP3 (reverse) GACAATGGCGTTTCTCGT UCP4 (forward) GCCGAATAATGAACCAAC 150 UCP4 (reverse) ACCAAGGGGTCATTCTCA UCP5 (forward) TGCCTTGTTCCGAATCTA 191 UCP5 (reverse) AATCACTCCTGACACTACCC Actin (forward) AAAGACCTCTATGCCAACA 196 Actin (reverse) ACATCTGCTGGAAGGTGG 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù) 數(shù)據(jù)都表示為平均值 177。標(biāo)準(zhǔn)誤差， 在 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。體重和食物攝入量的變化檢測(cè)使用重復(fù)測(cè)量方差分析。采用皮爾森相關(guān)系數(shù)分析來檢驗(yàn) H2O2 和 MDA 水平并 TAOC 和 GSHPx 活性之間的關(guān)系。 P 被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著意義。 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法處理和分析數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。 四、試驗(yàn)結(jié)果 體重和食物攝入量 3 個(gè)小組黑線倉鼠的體重在 實(shí)驗(yàn)開始前并沒有顯著的區(qū)別 (d0， F2,22 = ， P， 圖1A)， 并且經(jīng)過六個(gè)星期的馴化后， 3個(gè)小組黑線倉鼠的體重也沒有顯著的差別 (d2， F2,22=，P； d42， F2,22=， P)。 3 個(gè)小組黑線倉鼠的食物攝入量在第一天的時(shí)候沒有顯著的差別 (d0， F2,22=， P，圖 1B)， 但從第二天開始一直到 42 天，相對(duì)于對(duì)照組，在 5176。C 環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其食物攝入量明顯增加，而在 176。C 環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則明顯減少 (d2， F2,22=， P， d42， F2,22=， P，圖 1B)。 溫州大學(xué)本科畢業(yè)論文 溫度對(duì)黑線倉鼠抗氧化能力和解偶聯(lián)蛋白表達(dá)的影響 6 圖 1 在不同溫度 （ 5176。C， 21176。C， 176。C） 馴化下黑線倉鼠的體重變化 （ A） 和食物攝入量 (B)。數(shù)據(jù)平均值 177。 SE, **P。 Figure 1. Effect of temperature on body mass (A) and food intake (B) in striped hamsters acclimated to 5176。C, 21176。C and 176。C. Data are means 177。 SE, **P. 總能量攝入與消化率 總能量攝入受溫度的影響，相對(duì)于對(duì)照組在 5176。C 環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入增加，而在 176。C 環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其總能量攝入則減少 (F2,22=， P， post hoc，P，圖 2A)。相對(duì)于對(duì)照組，在 5176。C 環(huán)境中馴化的黑線倉鼠產(chǎn)生的糞便較多，而在 176。C環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則反之 (F2,22=， P， post hoc， P，圖 2B)。 3個(gè)小組的消化能量攝入存在著 差異，相對(duì)于對(duì)照組在 5176。C 環(huán)境中馴化的黑線倉鼠其消化能量攝入提高了 %，而在 176。C 環(huán)境中馴化的黑線倉鼠則降低了 % (F2,22=， P， post hoc， P，圖 2C)。然而 3 個(gè)小組之間的消化率并沒有明顯的差別 (F2,22=， P，圖 2D)。 22263034380 6 12 18 24 30 36 42Body mass (g)0369120 6 12 18 24 30 36 42D aysFood intake (g)5 176。C2 1 176。C3 2 .5 176。CA Body mass (g) 0369120 6 12 18 24 30 36 42Food intake (g)B ** Food intake (g/d) Days 溫州大學(xué)本科畢業(yè)論文 溫度對(duì)黑線倉鼠抗氧化能力和解偶聯(lián)蛋白表達(dá)的影響 7 圖 2 溫度對(duì)黑線倉鼠總能量攝入 （ GEI， A） ，糞便的總能量 （ GE）（ B） ，消化能量攝入 （ DEI， C） 和消化率 （ D） 的影響。數(shù)據(jù)平均值 177。 SE, **P。 Figure 2. Effect of temperature on gross energy intake (GEI, A), gross energy (GE) of feces (B), digestive energy intake (DEI, C) and digestibility (D) in striped hamsters. Data are means 177。 SE, **P. 褐色脂肪組織（ BAT）蛋白質(zhì)含量 如表 2 所示，在 5176。C 環(huán)境中馴化的黑線倉鼠的褐色脂肪組織（ BAT）蛋白質(zhì)含量明顯高于對(duì)照組以及在 176。C 環(huán)境中馴化的黑線倉鼠。肝臟、心臟、肌肉以及大腦中的蛋白質(zhì)都不受溫度的影響。 表二：黑線倉鼠不同組織適應(yīng)不同溫度對(duì)蛋白質(zhì)濃度的影響。 Table 2. Effect of acclimation to different temperatures on protein concentration in different tissues in the striped hamster. a 5176。C 21176。C 176。C P Liver 177。 177。 177。 ns Heart 177。 177。 177。 ns Muscle 177。 177。 177。 ns Brain 177。 177。 177。 ns BAT，褐色脂肪組織。 數(shù)據(jù)平均值 177。 SE, **P； ns，非顯著(P)。 BAT, brown adipose tissue. Data are means 177。 SE, **P, ns, nonsignifi