信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方法(1)-文庫吧
2025-04-22 05:14 本頁面
【正文】 PhosphospecificELISAs (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ? 檢測蛋白質(zhì)表達(dá)量或者活性狀態(tài) (化學(xué)修飾 磷酸化 ) ? 比 western blot更快速、更高效 . 蛋白質(zhì)組（ proteome）： 一個(gè)基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) . 蛋白質(zhì)組學(xué)（ proteomics)： 研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)。 蛋白質(zhì)組學(xué) (Proteomics) ? 同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同； ? 在空間和時(shí)間上呈動(dòng)態(tài)變化 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺(tái) (高效率 ,高通量 ) ? 雙向電泳分離樣品蛋白質(zhì) ? 蛋白質(zhì)點(diǎn)的定位和切取 ? 質(zhì)譜分析 第一向： 等電聚焦電泳 （ IEF） 第二向： SDSPAGE電泳 免疫熒光技術(shù)Immunofluorescence (IF) ? 利用某些熒光素如 FITC等通過化學(xué)反應(yīng)與抗體或其它蛋白結(jié)合制備成熒光探針，然后與被測抗原或配體發(fā)生特異性結(jié)合，形成的熒光復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此利用熒光顯微鏡可對抗原進(jìn)行定性或定位檢測。 ? 采用流式細(xì)胞免疫熒光技術(shù)（ FCM）可從單細(xì)胞水平檢測不同細(xì)胞亞群中的蛋白質(zhì)分子，用兩種不同的熒光素分別標(biāo)記抗不同蛋白質(zhì)分子的抗體，可在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)檢測兩種不同的分子（ Double IF） ，也可用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對胞內(nèi)多種分子進(jìn)行檢測。 2. 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) : ? CoIP（ 免疫共沉淀 ） with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein ? GST pulldown assay ? Yeast twohybrid assay ? FRET (fluorescence resonance energy transfer) assay agarose bead ? IP 是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“ protein A/G‖能特異結(jié)合免疫球蛋白 FC片段的現(xiàn)象而發(fā)展的方法。目前多用精制的 protein A/G預(yù)先結(jié)合固化在 agarose beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后， beads上的prorein A/G就能吸附抗原抗體達(dá)到沉淀抗原的目的。 protein A 抗原 抗體 Y A B Y 裂解細(xì)胞 免疫沉淀蛋白質(zhì) X 免疫共沉淀（ CoIP）技術(shù) 非變性條件下裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。若用蛋白質(zhì) X的抗體免疫沉淀 X，那么與 X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y也能沉淀下來。進(jìn)一步進(jìn)行 Western Blot和質(zhì)譜分析。常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 缺點(diǎn)：可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)相互作用。 Western Blot和質(zhì)譜分析 CoIP工作示意圖 Coimmunoprecipitation binding wash elution Y Y GST融合蛋白進(jìn)行 Pulldown實(shí)驗(yàn) GST pulldown assay 原理 將 GST融合蛋白 (tagged protein (標(biāo)記蛋白 ) or the bait (餌蛋白 )， GST, His6, Flag, biotin … )作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白 (test protein, or prey被撲獲蛋白 )結(jié)合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白。一般在發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用 GST沉降技術(shù)。該方法只是用于確定體外的相互作用。 GSTPulldown Assay 轉(zhuǎn)錄激活因子 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (BD) 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 (AD) 酵母雙雜交技術(shù) 酵母雙雜
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