【正文】 些新技術(shù)、新方法的發(fā)展， 可望形成性能優(yōu)良的蛋白質(zhì)分離與富集技術(shù)平臺(tái)。 在重大疾病蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)新方法方面：通過發(fā)展針對癌細(xì)胞、組織 的核酸適配體篩選新方法，將差異蛋白質(zhì)組鑒別有效的嵌入在核酸篩選過程中， 既避免了對大量蛋白質(zhì)的平行定量分析，又解決了低豐度蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)存在 的檢測靈敏度低的難題，可望成為本項(xiàng)目自主創(chuàng)新的重大突破，成為重大疾病蛋 白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的重要技術(shù)手段。 在惡性腫瘤等重大疾病早期診斷方面 : 提出以核酸適配體分 子識別指紋 圖譜作為腫瘤早期診斷、分型的方法，在腫瘤分型與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性間建 立新的對應(yīng)關(guān)系，為臨床治療方案的確立提供新依據(jù)。通過創(chuàng)新性地結(jié)合納米生 物技術(shù)與核酸適配體分子工程技術(shù)，獲得一系列高靈敏、實(shí)時(shí)的生物檢測新方法 與新器件，將為表達(dá)差異小、低豐度生物靶標(biāo)的鑒定與研究提供關(guān)鍵的檢測技術(shù) 與方法，可望在重大疾病的早期診斷方法學(xué)與技術(shù)基礎(chǔ)方面取得創(chuàng)新性成果。 本項(xiàng)目具有以下特色： （ 1）創(chuàng)新性強(qiáng)。面向國家需求發(fā)展癌癥等重大疾病早期診斷新方法，利用 新的蛋白質(zhì)識別技術(shù)，提出基于核酸 適配體的系列蛋白質(zhì)研究新技術(shù)與新方法。 并以此為契機(jī)對核酸適配體篩選與識別中的基本科學(xué)問題進(jìn)行系統(tǒng)的研究與闡 述。 （ 2）突出理論與應(yīng)用的交叉。系統(tǒng)研究核酸適配體分子識別體系的識別規(guī) 律，建立核酸適配體篩選的統(tǒng)計(jì)理論與模型，在理論層次上指導(dǎo)基于核酸適配體 的蛋白質(zhì)分離與檢測新技術(shù)與新方法的設(shè)計(jì)與應(yīng)用。 （ 3）研究內(nèi)容覆蓋了生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、蛋白質(zhì)科學(xué)、納米技術(shù)等學(xué)科， 體現(xiàn)了多學(xué)科交叉融合的特色。 （ 4）項(xiàng)目組在核酸適配體篩選、蛋白質(zhì)分離與檢測、惡性腫瘤早期診斷、 生物傳感技術(shù) 、納米生物分析技術(shù)等方面具備非常強(qiáng)的研究基礎(chǔ)，優(yōu)勢互補(bǔ)，為 項(xiàng)目的高效率實(shí)施提供了保障。 （四）可行性 本項(xiàng)目根據(jù)設(shè)定的研究目標(biāo)和內(nèi)容，凝聚了一支來自國內(nèi)主要優(yōu)勢單位的多 學(xué)科緊密配合的創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)，共有 8個(gè)不同學(xué)科的國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室或部門重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室參與研究工作，研究條件互補(bǔ)性強(qiáng)，具備了開展本項(xiàng)研究的軟硬件條件。 各參加單位在相關(guān)研究領(lǐng)域有長期的研究積累，而且已經(jīng)合作開展了與本項(xiàng)目相 關(guān)的前期研究工作 ,并取得具有國際影響的創(chuàng)新性成果。 在核酸適配體篩選方法方面：主要承擔(dān)單位湖南大學(xué)、中 科院化學(xué)所和中國 醫(yī)學(xué)科學(xué)院多年來在各種類型蛋白質(zhì)體系的核酸適配體篩選等諸多方面積累了 相當(dāng)豐富的經(jīng)驗(yàn)，具有較強(qiáng)的綜合研究能力。譚蔚泓教授已經(jīng)開展了系列的癌細(xì) 胞特異性核酸適配體篩選與應(yīng)用研究，具有重大的國際影響，近期他得到國家 “千 人計(jì)劃 ”的支持回湖南大學(xué)工作，與中科院化學(xué)所合作建成了核酸適配體篩選技 術(shù)平臺(tái)，已成功篩選出白血病癌、肺癌、肝癌、丙肝病毒等特異結(jié)合的核酸適配 體，發(fā)現(xiàn)了不同類型癌細(xì)胞具有不同的特征核酸適配體分子識別譜。中國醫(yī)學(xué)科 學(xué)院開展了對腫瘤組織樣本的核酸適配體篩選初步工作 。這些工作為本項(xiàng)目針對 食管癌、肝癌樣品的核酸適配體篩選提供了理論與技術(shù)保障。 在基于核酸適配體的蛋白質(zhì)分離與定量檢測方法方面 :湖南大學(xué)、中科院長 春應(yīng)用化學(xué)所、南京大學(xué)等主要承擔(dān)單位都是長期從事蛋白質(zhì)研究的國內(nèi)優(yōu)勢單 位 , 在核酸適配體生物傳感技術(shù)、分子探針成像技術(shù)、納米生物技術(shù)、生物微陣 列分析、微流控芯片技術(shù)等諸多方面具有很強(qiáng)的綜合研究能力。湖南大學(xué)在復(fù)雜 多維數(shù)據(jù)分析、圖譜解析與專家系統(tǒng)、知識庫搜索與知識發(fā)現(xiàn)等化學(xué)計(jì)量學(xué)領(lǐng)域 有很強(qiáng)的研究實(shí)力 ,曾獲得國家自然科學(xué)二等獎(jiǎng)，為核 酸適配體分子圖譜的解析 及相關(guān)生物信息的發(fā)現(xiàn)與挖掘提供了理論與技術(shù)保障。中科院長春應(yīng)用化學(xué)所、 南京大學(xué)在核酸與蛋白界面組裝、納米技術(shù)、電化學(xué)、微電極系統(tǒng)方面研究成果 豐碩，均曾獲得國家自然科學(xué)二等獎(jiǎng)，為蛋白質(zhì)研究新方法的突破奠定了堅(jiān)實(shí)的 基礎(chǔ)。 在基于核酸適配體的蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)方法方面 : 主要承擔(dān)單位之一的中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所是長期從事惡性腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究的國 內(nèi)優(yōu)勢單位 , 是一個(gè)醫(yī)療服務(wù)輻射全國的大型腫瘤專科醫(yī)院，具有豐富的臨床資 源，擁有豐富的癌組織、血清、癌細(xì)胞系 儲(chǔ)備，已獲得了相關(guān)疾病的多個(gè)重要標(biāo) 志物和蛋白質(zhì)靶標(biāo)，建立了靶向治療載體平臺(tái)技術(shù)與相關(guān)動(dòng)物模型，成功研究了 多種抗腫瘤疫苗與藥物。湖南大學(xué)譚蔚泓教授利用白血病篩選的核酸適配體，通 過癌細(xì)胞特異性膜蛋白的富集與質(zhì)譜分析，成功發(fā)現(xiàn)與鑒定相關(guān)癌細(xì)胞特異性膜 蛋白標(biāo)志物，相關(guān)成果連續(xù)在 PNAS上發(fā)表，證明了本項(xiàng)目技術(shù)的可行性。通過本 項(xiàng)目實(shí)施與多學(xué)科的交叉合作，可望為相關(guān)重大疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供新方法和 技術(shù)平臺(tái)，具有取得原始創(chuàng)新的重要研究成果與自主知識產(chǎn)權(quán)的關(guān)鍵技術(shù)突破的 可能。 在基于核酸適配體 的癌癥早期診斷方法方面：本項(xiàng)目一方面將核酸適配體 技術(shù)與納米技術(shù)、生物傳感技術(shù)、分子成像技術(shù)等結(jié)合發(fā)展相關(guān)重大疾病個(gè)性化 分子診斷新方法。另一方面，本項(xiàng)目提出將核酸適配體分子識別圖譜方法用于癌 癥早期診斷與分子分型，這一自主創(chuàng)新的關(guān)鍵技術(shù)可在對惡性腫瘤等重大疾病蛋 白質(zhì)標(biāo)志物、及腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚的條件下，發(fā)展腫瘤特異性分 子探針組，進(jìn)而探索疾病發(fā)生、發(fā)展過程中蛋白質(zhì)標(biāo)志物的分子指紋與表達(dá)、變 化模式，從而實(shí)現(xiàn)對應(yīng)惡性腫瘤的個(gè)性化分子診斷與治療。此外，基于核酸適配 體分子識別圖譜， 也可以發(fā)現(xiàn)新的疾病標(biāo)志物，進(jìn)行新藥開發(fā)和病變分子機(jī)理的 基礎(chǔ)研究。在此意義上，本項(xiàng)目的實(shí)施將可望為重大疾病早期診斷以及發(fā)生、發(fā) 展機(jī)制的研究開辟新途徑。 總之，本項(xiàng)目給出的技術(shù)路線和研究思路充分考慮了原理與方法的可行性， 既保證了創(chuàng)新性和預(yù)期成果的水平，又充分考慮了已有工作的基礎(chǔ)，可保障研 究目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。因此，研究技術(shù)路線先進(jìn)可行，已經(jīng)具備了取得重大突破的條 件。經(jīng)過本項(xiàng)目的研究，可望在核酸適配體的篩選、蛋白質(zhì)的分離與定量檢測 新方法、惡性腫瘤的蛋白質(zhì)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、癌癥等重大疾病早 期診斷等蛋白質(zhì) 研究的新技術(shù)與新方法方面取得重大突破。 (五 ) 課題設(shè)置 本研究項(xiàng)目將以解決當(dāng)前蛋白質(zhì)研究中的瓶頸問題為總目標(biāo)，圍繞四個(gè)關(guān)鍵科學(xué) 問題，發(fā)展基于核酸適配體的蛋白質(zhì)研究的新方法、新技術(shù)。根據(jù)核酸適配體技 術(shù)基礎(chǔ)、理論基礎(chǔ)、關(guān)鍵方法學(xué)與應(yīng)用三個(gè)方面的研究內(nèi)容與預(yù)期目標(biāo)，設(shè)置四 個(gè)課題 : 課題 1 核酸適配體篩選新方法的基礎(chǔ)研究 課題 2 基于核酸適配體的蛋白質(zhì)定量檢測新方法研究 課題 3 課題 4 基于核酸適配體的蛋白質(zhì)分離與富集新技術(shù)研究 重大疾病蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的新方法研究 如上圖所示，這些課題既相對獨(dú)立，又互相交叉。課題 1 是其它 3 個(gè)課題的 基礎(chǔ)，為課題 2 和課題 3 的實(shí)施提供理論指導(dǎo)與研究工具，也為課題 4 中蛋白質(zhì) 標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供新的技術(shù)依據(jù)和平臺(tái)；課題 2 和課題 3 在課題 1 的指導(dǎo)下，以課 題 4 涉及的目標(biāo)為對象，建立高靈敏、高選擇性、高通量的蛋白質(zhì)分離與檢測新 方法，提供技術(shù)平臺(tái)，并針對癌癥早期診斷這一應(yīng)用出口進(jìn)行驗(yàn)證；課題 4 是課 題 3 研究的外延與主要應(yīng)用 出口，主要開展蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的新方法與 癌癥早期診斷的核酸適配體分子識別圖譜方法研究，該課題反過來也為課題 3 的實(shí)施提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 4 個(gè)課題的研究成果可相互借鑒，同時(shí)課題 24 為課 題 1 研究提供了驗(yàn)證，而課題 4 研究過程中，有可能發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，也 將納入到課題 3 中建立相關(guān)的分離與檢測的技術(shù)平臺(tái)。數(shù)個(gè)課題共同完成核 酸適配體的分子識別機(jī)理、蛋白質(zhì)分離與分析檢測方法、蛋白質(zhì)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)與癌 癥早期診斷應(yīng)用的研究。研究組成員通過聯(lián)合研究，協(xié)同公關(guān)，優(yōu)勢互補(bǔ)，共同 促進(jìn)，有分工，有協(xié)作，體現(xiàn)了整體的團(tuán)隊(duì)精神。 課題 1 核酸適配體篩選新方法的基礎(chǔ)研究 參加單位： 湖南大學(xué)， 中國科學(xué)院化學(xué)研究所 負(fù)責(zé)人：譚蔚泓教授 學(xué)術(shù)骨干：俞汝勤院士，方曉紅教授，蔣健暉教授，李繼山副教授 經(jīng)費(fèi)比例： 28% 研究目標(biāo)： 發(fā)展細(xì)胞、組織等不同多蛋白質(zhì)復(fù)合靶標(biāo)體系核酸適配體篩選方法，通過化 學(xué)合成、目標(biāo)篩選、分子裁減、功能化衍生等手段，設(shè)計(jì)、合成并篩選具有獨(dú)特 優(yōu)良性能的核酸適配體；研究這類復(fù)合體系核酸適配體的分子識別圖譜；闡明核 酸適配體的分子識別基礎(chǔ)，為課題 2與 3中蛋白質(zhì)定量檢測與分離新方法的研究提 供指導(dǎo)。 主要研究內(nèi)容： 1. 核酸適配體文庫設(shè)計(jì)和篩選基礎(chǔ)研究：合成含有 2060 個(gè)隨機(jī)堿基長度 的系列高質(zhì)量 DNA 和 RNA 文庫；從隨機(jī)文庫中核酸結(jié)構(gòu)的多樣性、不同核酸 高級結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)結(jié)合力的差異、核酸二級結(jié)構(gòu)冗余性與 PCR 擴(kuò)增效率的序列特異 性三個(gè)方面，對篩選過程中影響核酸適配體富集的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，分析篩選 過程中核酸適配體的進(jìn)化規(guī)律，以保證篩選過程中文庫結(jié)構(gòu)的多樣性和配體的無 偏擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)基于配體與靶標(biāo)親和力差異的核酸適配體高 效進(jìn)化。 2. 復(fù)合靶標(biāo)體系核酸適配體篩選方法：以細(xì)胞、組織等靶標(biāo)為重點(diǎn)，通過 優(yōu)化篩選條件與流程，發(fā)展針對不同生物靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化篩選方法，建立高效的 活細(xì)胞、組織體系的核酸適配體篩選平臺(tái)。 3. 核酸適配體分子識別性質(zhì)研究：建立表征核酸適配體分子與生物靶標(biāo)結(jié) 合性質(zhì)的各種譜學(xué)研究方法，表征篩選出的核酸適配體與靶標(biāo)結(jié)合的親和力和 特異性，進(jìn)行核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)分析和序列裁減；研究核酸適配體與靶標(biāo) 結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系，闡明核酸適配體的分子識別機(jī)制。通過分子模擬，建立核酸 適配體分子識別 的理論模型，指導(dǎo)核酸適配體分子探針的設(shè)計(jì)。 4. 核酸適配體分子識別圖譜研究：根據(jù)核酸適配體篩選與表征的結(jié)果，構(gòu) 建核酸適配體分子探針組合，分析核酸適配體組對大量不同腫瘤樣品的分子識 別圖譜，建立肝癌、食管癌的核酸適配體組的分子識別模式。結(jié)合大樣本的臨 床評價(jià)，進(jìn)一步研究核酸適配體特征分子識別圖譜用于相關(guān)腫瘤診斷的可行性， 建立相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，探討核酸適配體特征分子識別指紋圖譜的早期診斷價(jià)值。 課題 2 基于核酸適配體的蛋白質(zhì)定量檢測新方法研究 參加單位： 中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所 , 湖南大學(xué) , 蘇州大學(xué) 負(fù)責(zé)人：于聰教授 學(xué)術(shù)骨干：董紹俊教授，劉莊教授，羊小海教授，聶舟副教授 經(jīng)費(fèi)比例： 23% 研究目標(biāo)： 以課題 1篩選的核酸適配體及其分子識別基礎(chǔ)研究為依據(jù)，將納米技術(shù)、微 陣列技術(shù)與核酸適配體技術(shù)相結(jié)合，引進(jìn)高靈敏度的光、電、磁等傳感技術(shù)，建 立核酸適配體在各類界面的可控修飾技術(shù)，發(fā)展高靈敏、高通量、高選擇性的蛋 白質(zhì)定量檢測方法與傳感器，并針對癌癥早期診斷應(yīng)用開展蛋白質(zhì)標(biāo)志物檢測技 術(shù)研究。 主要研究內(nèi)容： 1．核酸適配體的功能化與分子探針的制備：研究不影響核酸 適配體特異性 的化學(xué)修飾、標(biāo)記、與組裝方法，結(jié)合納米生物技術(shù)，制備靈敏、簡便、經(jīng)濟(jì)的 核酸適配體分子探針。 2. 基于核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測新原理與新方法：設(shè)計(jì)構(gòu)象互變型與鏈置 換型熒光分子探針，發(fā)展均相、高通量的蛋白質(zhì)檢測新方法。利用核酸適配體修 飾的納米雙色傳感顆粒、光 磁復(fù)合納米探針，發(fā)展細(xì)胞、組織、活體等水平的 分子成像新原理與新方法，并開展癌癥早期診斷應(yīng)用研究。 3. 基于核酸適配體的傳感器構(gòu)建基礎(chǔ)研究：利用核酸適配體分子識別原理， 以微納技術(shù)為基礎(chǔ)，綜合運(yùn)用各種納米技 術(shù)如自組裝、原位沉積、物理插入、化 學(xué)修飾等傳感界面固定化方法，構(gòu)建微納結(jié)構(gòu)傳感界面，制作核酸適配體的微納 傳感器、微陣列，并探索提高這些傳感體系修飾的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性的方法，研究 微傳感結(jié)構(gòu)界面仿生分子識別體系探針分子的負(fù)載量、空間取向與識別量的關(guān) 系。 4．基于核酸適配體的蛋白質(zhì)傳感器技術(shù)：基于納米金、量子點(diǎn)、硅納米熒 光粒子，介孔納米材料、碳納米管和磁性納米粒子等，發(fā)展用于高靈敏生物傳感 的核酸適配體探針，基于核酸放大技術(shù)，發(fā)展微陣列檢測中基于光、電、磁信號 傳導(dǎo)與放大的新方法；研制高靈 敏的壓電、阻抗、可視、熒光及表面等離子共振