973項(xiàng)目申報(bào)書――重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究-文庫(kù)吧
2025-08-02 08:15 本頁面
【正文】 mmunoprecitation， ChIP）、凝膠遷移或電泳遷移率檢測(cè)（ Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）等技術(shù)研究 DNA與蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（ Coimmunoprecipitation， CoIP）、 GSTpull down、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、雙分子熒光互補(bǔ)（ bimolecular fluorescence plementation， BiFC）等技術(shù)研究蛋白相互作用； 對(duì)一些重要蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析、并對(duì)其進(jìn)行泛素化、乙酰化和磷酸化等修飾分析； 8. 鑒定兩性生殖鯽魚卵子中雙親特異性甲基化、發(fā)育不等性基因， 分析單性生殖鯽魚三倍體卵子中相關(guān)同源基因啟動(dòng)子 CpG 島甲基化差異和基因表達(dá)調(diào)節(jié)差異，確定發(fā)生差異甲基化的目標(biāo)基因；比較分析兩性生殖與單性生殖鯽魚卵子基因組中差異甲基化功能基因啟動(dòng)子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。 9. 采用正常的和人工突變后的基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，輔以其它分子生物學(xué)方法如目的基因表達(dá)產(chǎn)物體內(nèi)、外誘導(dǎo)處理等來分析目的基因的生理功能； 10. 用顯微注射方法研究基因功能。將含有這些基因的真核表達(dá)載體，或在大腸桿菌中表達(dá)出的蛋白，注射到胚胎中或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 11. 將目的基因的反義 RNA或其蛋白的抗體注射到胚胎中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 12. 對(duì)生殖調(diào)控基因而言，設(shè)立人工性反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，分別提取不同性反轉(zhuǎn)階段實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表達(dá)的時(shí)序性； 13. 對(duì)生長(zhǎng)和生殖功能基因而言，合成重要調(diào)控生長(zhǎng)生殖基因的結(jié)構(gòu)類似物或表達(dá)具有生物活性重組蛋白，取魚類的下丘腦、垂體、肝臟和性腺，通過碎片灌流和細(xì)胞孵育等離體研究方法，或直接注射結(jié)構(gòu)類似物或重組蛋白，采用放射免疫測(cè)定等方法研究其活性，測(cè)定各種靶組織、血清中調(diào)控生殖生長(zhǎng)激素的含量，分析這些生長(zhǎng)調(diào)控因子和生殖調(diào)控因子的相互作 用及其信號(hào)傳遞機(jī)制，分析它們對(duì)魚類生殖和生長(zhǎng)的影響； 14. 通過體外合成小分子 RNA，建立魚類系統(tǒng)中適用于實(shí)驗(yàn)室日常工作的、簡(jiǎn)潔、高效的 siRNA 技術(shù)平臺(tái)；通過克隆獲得的魚類來源的啟動(dòng)子構(gòu)建針對(duì)草魚出血病病毒的 siRNA 載體，建立抗病轉(zhuǎn) siRNA 基因魚模型；通過 Creloxp 介導(dǎo)的系統(tǒng)進(jìn)行魚類胚胎中的條件基因打靶研究；建立魚類胚胎干細(xì)胞和生殖干細(xì)胞系，建立魚類培養(yǎng)細(xì)胞體外基因操作和個(gè)體重建技術(shù)途徑； 15. 通過 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降技術(shù)，配合整體原位雜交、細(xì)胞示蹤等方法，研究目的基因的生理 學(xué)功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、信號(hào)通路和作用機(jī)理等； 16. 采用已經(jīng)建立的細(xì)胞模型，研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染目的基因和 siRNA 干擾等技術(shù)手段，研究目的基因的生理學(xué)功能以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 17. 通過 AFLP 和微衛(wèi)星等遺傳標(biāo)記的大規(guī)模篩選，鑒定出與魚類性別等等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)而通過 Genomic walking 克隆鑒定相關(guān)功能基因；通過人工選育和家系分析，利用遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因型分析的優(yōu)勢(shì)，研究特定標(biāo)記與某些經(jīng)濟(jì)性狀（例如生長(zhǎng)、性別、抗病或抗寒）的連鎖關(guān)系，進(jìn)行分子標(biāo) 記輔助育種；開展魚類生長(zhǎng)、飼料轉(zhuǎn)化率等經(jīng)濟(jì)性狀的 QTL 定位分析和eQTL 定位分析； 18. 改造基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除載體系統(tǒng)，優(yōu)化基因敲除載體，引入更多的克隆位點(diǎn)，以簡(jiǎn)化特異基因敲除載體的構(gòu)建；利用 Zinc Finger Tools 網(wǎng)上軟件包（ ） ,選取代表性基因進(jìn)行鋅指結(jié)構(gòu)域的索尋，選擇連續(xù) 20 或 30 個(gè)氨基酸的合適結(jié)構(gòu)域，依據(jù)針對(duì) DNA 三聯(lián)體的經(jīng)驗(yàn)鋅指氨基酸序列，設(shè)計(jì)靶標(biāo)多肽和堿基序列；將靶標(biāo)多肽的 DNA 片段克隆到經(jīng)改進(jìn)后的基因敲除載體上；體外合成 mRNA,顯微注射；觀察表型，并利用 PCR 檢測(cè)顯微注射個(gè)體的基因型，獲得雜合體；將雜合體個(gè)體擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行相互交配，以獲得基因的兩個(gè)拷貝均缺失的純合體；系統(tǒng)分析基因缺失純合體的表型。 技術(shù)途徑的示意圖如下： 細(xì)胞示蹤等研究細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)方法、胚胎細(xì)胞移植等 體外孵育或灌流結(jié)合放射性免疫測(cè)定研究生理功能 DNA 甲基化分析 啟動(dòng)子分析 morpholino 介導(dǎo)、 siRNA 干擾等基因敲降方法 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除 模式魚類（斑馬魚、青 鳉 、河豚、三棘刺魚 等 ）全基因組信息 前期 已獲得 的 大量與魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性相關(guān)基因資源 已建立 的大批魚類細(xì)胞系 魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性的主控 基因和分子標(biāo)記的功能揭示和作用機(jī)理闡明 比較轉(zhuǎn)錄基因組分析 Western、免疫組化、 WISH 等研究時(shí)空表達(dá)譜等方法 CoIP、 GSTpull down、 FRAP、 FRET、BiFC 等研究蛋白相互作用方法 ChIP、 EMSA 等研究核酸與蛋白相互作用等方法 FACS、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)泛素化、乙?；刃揎椃治? 魚類分子設(shè)計(jì)育種數(shù)量性狀多基因聚合技術(shù) 魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù) 多基因信息整合 性狀的 QTL與 eQTL分析 基因同線性與性狀關(guān)聯(lián)性分析 蛋白分子設(shè)計(jì)、 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu) 的基因敲除方法、 BAC 或Tol2 轉(zhuǎn)座子、 Cre/lox、 PGC 操作、miRNA和 piRNAs 調(diào)控 魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析 魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和可行性途徑 （三）、創(chuàng)新點(diǎn)與特色： 1) 重要的研究對(duì)象，體現(xiàn)了國(guó)家重大需求導(dǎo)向： 本項(xiàng)目以我國(guó)重要養(yǎng)殖魚類鯽、鯉等為主要研究對(duì)象，圍繞水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新所要解決的魚類分子設(shè)計(jì)育種 的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問題開展研究，著眼于解決國(guó)家中長(zhǎng)期發(fā)展中所需要解決的重大科學(xué)問題，體現(xiàn)了重大的國(guó)家需求導(dǎo)向。 2) 獨(dú)特的研究體系，注重發(fā)揮中國(guó)特色和優(yōu)勢(shì)： 銀鯽多倍體的遺傳背景和同時(shí)具有的雌核發(fā)育生殖和有性生殖雙重生殖方式以及性逆轉(zhuǎn)魚類奇特的性別分化現(xiàn)象為解析魚類生殖和性控的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了 新穎、 獨(dú)特的研究體系，有利于發(fā)揮我國(guó)的特色和優(yōu)勢(shì)。 3) 新 穎 的學(xué)術(shù)思路， 起到前瞻性、戰(zhàn)略性和引領(lǐng)性作用 ： 本項(xiàng)目瞄準(zhǔn)了國(guó)際上有關(guān)魚類分子設(shè)計(jì)育種的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題，試圖直接通過解析魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來闡明其調(diào)控機(jī)理，篩選鑒定可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，由此創(chuàng)建魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，對(duì) 指導(dǎo)并推動(dòng)我國(guó)水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展具有重要的前瞻性、戰(zhàn)略性和引領(lǐng)性作用。 （四）、可行性分析： 1) 厚實(shí)的前期研究基礎(chǔ)，目標(biāo)明確： 魚類等水產(chǎn)動(dòng)物的分子設(shè)計(jì)育種研究雖然還處于起步階段，但可喜的是，隨著斑馬魚、河 鲀 和青 鳉 等模式魚類全基因組測(cè)序的完成和基因功能研究的不斷深入，一些重要養(yǎng)殖魚類的功能基因組研究已進(jìn)展很快，特別是我們這個(gè)團(tuán)隊(duì)在上一期 973 計(jì)劃 “ 重要魚 類品種改良的遺傳和發(fā)育基礎(chǔ)研究 ” 的支持下，已篩選鑒定出一批與我國(guó)主要養(yǎng)殖魚類的生殖、生長(zhǎng)、抗性等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因和分子標(biāo)記，建立了 10 多個(gè)養(yǎng)殖魚類細(xì)胞系， 積累了 厚實(shí)的前期研究基礎(chǔ)。本項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容是在這些基礎(chǔ)上進(jìn)一步凝聚而來，目標(biāo)更為明確。 2)
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