【正文】 信息，闡明 5 種以上 miRNA 對體節(jié)發(fā)生和肌肉祖細胞與間充質(zhì)細胞分化過程中關(guān)鍵基因的調(diào)控機制。 miRNA 文庫將達到國內(nèi)領(lǐng) 6 先和國際先進水平，同時使我國在 miRNA 對豬、雞骨骼肌和脂肪發(fā)育控制作用及其調(diào)控機制方面的研究進入國際先進行列。 揭示豬、雞肌肉和脂肪細胞分化與代謝過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子等關(guān)鍵基因的功能與作用機 制，探討 DNA 和組蛋白修飾對關(guān)鍵作用基因表達的影響，進一步闡明骨骼肌和脂肪發(fā)育與代謝的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制。這一目標(biāo)的實現(xiàn)，將進一步提高我們對豬、雞肌肉和脂肪發(fā)育分子調(diào)控機制的深入認(rèn)識，積累組織器官發(fā)育的新知識，為發(fā)育原理在畜牧生產(chǎn)與醫(yī)學(xué)實踐中的應(yīng)用提供指導(dǎo)作用。 揭示不同豬種（瘦肉型外來品種與脂肪型優(yōu)質(zhì)地方品種）、雞種或品系（蛋用型和肉用型、高脂系和低脂系）肌肉和脂肪組織之間的遺傳和表觀遺傳學(xué)分子差異及其與肉、脂性狀形成的關(guān)系。這是發(fā)育領(lǐng)域的開拓性研究，這將豐富我們對發(fā)育分子機理的認(rèn)識，將為我國豬、雞品種 資源的有效利用提供科學(xué)依據(jù)，增強我國畜牧生產(chǎn)的自主創(chuàng)新能力。 建立可用于生產(chǎn)實踐的 miRNA 雞的培育的技術(shù)方法。這一目標(biāo)的實現(xiàn)將是發(fā)育原理用于生產(chǎn)實踐的重大突破，雖然本目標(biāo)的實現(xiàn)存在一定風(fēng)險，但至少將在轉(zhuǎn)基因技術(shù)方面取得一定突破，為旨在提高生產(chǎn)性能、抗病性能和作為生物孵化器的轉(zhuǎn)基因雞培育提供可借鑒的理論技術(shù)資料。 發(fā)表研究論文 SCI 論文 40 篇以上，其中在影響因子 以上國際主流雜志發(fā)表論文 20 篇左右。申請發(fā)明專利 35 項。 打造一支高水平的科研隊伍，培養(yǎng)一批博士研究生（ 2025 人），碩士研究生（ 4060 人），博士后研究人員（ 510 人）。 7 三、研究方案 （一）實現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)的 總體 研究思路項目研究的技術(shù)路線及可行性分析 總體思路 豬和雞作為重要的模式生物和經(jīng)濟動物，近些年來對其遺傳與發(fā)育學(xué)研究已取得了一些重大突破。豬和雞基因組結(jié)構(gòu)被逐步解析，一些與肌肉和脂肪發(fā)育調(diào)控相關(guān)的重要基因也已被發(fā)現(xiàn)。 實際上 ， 肌細胞和脂肪細胞的分化、生長與發(fā)育調(diào)控是一系列相關(guān)基因的時序性表達和關(guān)閉的結(jié)果，對這些基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的全面解析是后基因組時代的主要研究內(nèi)容。目前，對 豬、雞肌肉和脂肪發(fā)育調(diào)控的研究主要集中在 基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄因子和分子標(biāo)志的時序性表達，以及關(guān)鍵基因調(diào)控 肌肉和脂肪分化和生長發(fā)育的功能揭示的研究，而對調(diào)控基因與調(diào)控因子產(chǎn)生 “程序化 ”作用的過程及其分子機制尚不清楚，特別是：（ 1）對肌肉和脂肪細胞組織發(fā)生、生長發(fā)育和分化的基本控制通路中許多上下游和平行作用的分子及其關(guān)聯(lián)尚待發(fā)掘， 對局部微環(huán)境中各種內(nèi)分泌和旁（自）分泌等信號分子如何通過細胞內(nèi)特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細胞的分化、發(fā)育和代謝過程也缺乏深入和系統(tǒng)的研究； （ 2）對肌肉和脂肪細胞分化過程中， DNA 與組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)特征如何調(diào)控功能基因的轉(zhuǎn)錄， miRNA 如何在此過程中對其基因表達的控制等方面的研究還剛剛起步；（ 3）品種（系）間 豬和雞 肌肉和脂肪分化和生長發(fā)育差異的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)的研究基本處于空白。 本項目針對上述問題展開研究，結(jié)合我們前期的工作基礎(chǔ)，運用現(xiàn)代生物技術(shù)的先進方法，從胚胎期組織發(fā)生、細胞分化、出生后生長和發(fā)育等多階段，在DNA、 RNA、蛋白質(zhì)等多層次上展開研究，期望在豬、雞骨骼肌和脂肪發(fā)育調(diào)控的遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)與外周信號調(diào)控機制多方面取得重大突破，為推進我國發(fā)育生物學(xué)、比較醫(yī)學(xué)和畜禽的遺傳育種研究與實踐奠定堅實理論與技術(shù) 基礎(chǔ)。 技術(shù)路線 建立豬、雞肌肉和脂肪干細胞庫和非編碼 RNA 庫，發(fā)掘豬、雞肌肉和脂肪 8 干細胞分化與組織發(fā)育的新功能基因和 miRNA，在豬和雞中靶向克隆在其他物種分離鑒定的肌肉和脂肪發(fā)育的基因和參與其調(diào)控的 miRNA，結(jié)合各種組織學(xué)技術(shù)、細胞學(xué)技術(shù)和其他分子生物學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)發(fā)掘豬、雞肌肉和脂肪干細胞分化與組織發(fā)育中的重要功能基因，研究其其功能和作用機制，并進行代表性種（系）間的系統(tǒng)比較，從而深入揭示畜禽肌肉和脂肪發(fā)育的分子機制。同時，進行 miRNA 雞培育新技術(shù)方法研究，力爭培育成功優(yōu)化肌肉和脂肪生長的 miRNA雞。 本項目從分子水平、細胞水平和動物模型整體水平 3 個層次開展研究。 分子水平研究的技術(shù)包括：高效毛細管電泳，免疫熒光技術(shù)，共聚焦顯微鏡技術(shù)， Western blot 技術(shù)，原位雜交，免疫組織熒光，染色質(zhì)免疫共沉淀，基因克隆，報告基因技術(shù)、基因缺失和點突變， 甲基化間區(qū)位點擴增， Gelshift 技術(shù)， 基因表達譜芯片技術(shù)，代謝譜分析技術(shù)，蛋白質(zhì)雙向電泳，蛋白質(zhì)飛行時間質(zhì)譜，時間分辨熒光分析，蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)等。 細胞水平研究的技術(shù)包括：基因顯性失活，過量表達，基因敲除， RNAi 技術(shù) ， miRNA 克隆與 功能分析技術(shù)，報告基因介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性模型及其檢測技術(shù)等。 動物模型整體水平研究的技術(shù)包括：豬和雞的基因敲入 技術(shù) 、敲除技術(shù)，活體雞胚基因干擾 技術(shù)、 基因過表達 技術(shù)， 豬和雞成體組織 技術(shù)等。 可行性分析 （ 1） 對肌肉與脂肪發(fā)育及其調(diào)控機理的研究有可靠的 理論基礎(chǔ)。 近年來，對鼠和人的肌肉與脂肪發(fā)育及其調(diào)控機理的認(rèn)識愈來愈深入， 肌細胞與 脂肪細胞的分化都是由一系列轉(zhuǎn)錄因子（ Pax3myoDmyoG、 C/EBPPPAR SREBP）順序調(diào)控的結(jié)果，其基本調(diào)控線路已初步得到解析。國內(nèi)外研究和本項目團隊前期對豬、雞肌 肉和脂肪發(fā)育的調(diào)控研究也取得了一定進展， 發(fā)現(xiàn)了大量與豬、雞肌肉和脂肪發(fā)育調(diào)控相關(guān)的功能基因 。這些工作為本項目研究取得重大突破提供了理論基礎(chǔ)。 9 （ 2）生命科學(xué)新的研究技術(shù)為本項目取得重大突破提供了技術(shù)可行性。 隨著后基因組學(xué)時代的到來，有關(guān)表觀遺傳學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的研究逐漸深入，新的生物學(xué)研究技術(shù)手段也日新月異?，F(xiàn)有蛋白質(zhì)飛行時間質(zhì)譜，染色質(zhì)免疫共沉淀芯片，核酸、蛋白質(zhì)和代謝組芯片，時間分辨熒光分析， RNAi 技術(shù) ，miRNA 轉(zhuǎn)入和轉(zhuǎn)出，以及病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動物模型建立等成熟的研究方法為本項目的順 利實施提供了重要的技術(shù)保障。 （ 3） 申請單位有良好的前期研究基礎(chǔ)。 本項目的研究團隊已開展大量的前期研究，已經(jīng)成功建立了豬、雞（包括大鼠、小鼠和人）原代成肌細胞、原代成熟脂肪細胞、原代前脂肪細胞的體外培養(yǎng)技術(shù)，并建立了豬、雞肌細胞和前體脂肪細胞誘導(dǎo)分化的研究方法，初步開展了豬、雞脂肪組織生長發(fā)育過程中基因表達譜分析和豬、雞脂肪分化重要調(diào)控基因的功能基因組學(xué)研究，成功地應(yīng)用 siRNA分別干擾了前脂肪細胞 PPARγ、 C/EBPα 和 SREBP1 基因的表達。 同時，闡明了脂肪細胞內(nèi)脂滴包被蛋白 Perilipin 和 ADRP 的泛素化修飾調(diào)節(jié)機制，研究了Perilipin 下調(diào)及其磷酸化調(diào)節(jié)脂肪分解的分子機制，對 PPARγ 激動劑及甾體類激素調(diào)節(jié)脂肪生成和脂肪分解的分子機制的研究也在進行。另外還從 mRNA 水平和蛋白水平，研究了豬脂肪代謝關(guān)鍵基因（ PNPLA ABHD5）和關(guān)鍵酶類(ATGL、 CGI5 HSL)在不同發(fā)育時期的組織表達特性。 對 中外豬種肌肉發(fā)育差異的分子機制研究以及豬和雞基因組非編碼 RNA 的研究也取得了進展。這些工作為開展本項目研究提供了良好的前期研究基礎(chǔ)。 （ 4）本項目的研究團隊具備很強的研究實力與 良好的研究平臺 。 本項目 集合我國這一領(lǐng)域的優(yōu)勢隊伍 。整個項目的主要參與人員都為創(chuàng)造力旺盛的中青年科學(xué)家，具有多年在歐美等國一流實驗室工作的經(jīng)驗和廣泛的文獻接觸面，對本研究領(lǐng)域的重大問題及技術(shù)手段都具有獨到的見解。本項目課題負(fù)責(zé)人和主要學(xué)術(shù)骨干都由具有多年研究經(jīng)驗和高度組織能力的學(xué)術(shù)帶頭人擔(dān)任，在發(fā)育生物學(xué)、細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域具有多年的研究經(jīng)驗。 開展本項目研究已有較好的技術(shù)平臺支撐，承擔(dān)單位擁有 2 個國家重點實驗室， 5 個部級重點實驗室，項目所需的絕大部分實驗儀器和實驗手段均已具備，各承擔(dān)單位間有著長期 的良好合作關(guān)系和基礎(chǔ)。本項目具有豐富的前期工作積累 10 與相關(guān)研究成果及多學(xué)科背景的研究隊伍，已經(jīng)建立起成熟的研究手段和方法，有能力完成所計劃的研究任務(wù)。 （二）項目的創(chuàng)新點 盡管已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)大量與豬、雞肌肉和脂肪發(fā)育調(diào)控相關(guān)的基因。但是， 目前國內(nèi)外的研究 主要集中在相關(guān) 基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄因子和分子標(biāo)志基因的時序性表達，以及關(guān)鍵基因調(diào)控 肌肉和脂肪分化和生長發(fā)育功能的研