【正文】 間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 ....................................................................... 14 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 ........................................................................... 14 目 錄 IV pH 對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響 .............................................................................. 15 溫度對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響 ........................................................................... 16 不 同金屬離子及離子濃度對(duì) β半乳糖苷酶的影響 ................................................ 17 第 4 章 酶的固定化研究 ................................................................................................. 18 固定化酶簡(jiǎn)介 .................................................................................................... 18 酶的固定方法 ................................................................................................... 19 包埋法 .................................................................................................... 19 吸附法 .................................................................................................... 19 吸附法 .................................................................................................... 19 交聯(lián)法 ..................................................................................................... 19 固定化酶反應(yīng)器的類型 ..................................................................................... 20 連續(xù)操作攪拌式反應(yīng)器 (Continuous Flow Stirred Tand Reactor， CSTR) ........ 20 固定床反應(yīng)器 (Packed Bed Reactor， PBR) .................................................. 21 流化床反應(yīng)器 (Fluidzed Bed Reactor， FBR) ................................................ 22 中空纖維反應(yīng)器 (Hollow Fiber Reactor) ...................................................... 22 固定化乳糖酶國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 ........................................................................... 23 國(guó)外研究進(jìn)展 .......................................................................................... 23 國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展 .......................................................................................... 24 β半乳糖苷酶 的 固定 .......................................................................................... 25 包埋材料選擇 .......................................................................................... 25 β半乳糖苷酶固定方法 ........................................................................... 25 固定酶活力測(cè)定 ...................................................................................... 25 固定化 的 最適條件 ............................................................................................ 26 海藻酸鈉濃度的確定 ............................................................................... 26 CaCl2 濃度的確定 .................................................................................... 26 固定化時(shí)間的確定 ................................................................................... 27 戊二醛交聯(lián)試驗(yàn) ....................................................................................... 27 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì) ......................................................................................... 28 固定化酶的最適 pH ................................................................................. 28 固定化酶的最適溫度 ................................................................................ 29 固定化酶的催化反應(yīng)機(jī)理探討 ........................................................................... 29 固定化酶對(duì)反應(yīng)體系的影響 ..................................................................... 30 影響固定化酶的動(dòng)力學(xué)因素 ..................................................................... 30 固定化酶保護(hù)劑的篩選 ..................................................................................... 31 參 考 文 獻(xiàn) .................................................................................................................. 33 致 謝 ........................................................................................................................... 34 第 1 章 緒 論 1 第 1章 緒 論 研究背景 β 半 乳 糖 苷 酶 （ βgalactosidase ）， 全 名 為 βD 半 乳 糖 苷 水 解 酶（ βDgalactoside galcagalcatohydrolase， ），常簡(jiǎn)稱為乳糖酶。一般說(shuō)來(lái)，該酶有兩種催化性質(zhì)：一是催化水解反應(yīng)，將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖；二是催化轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在乳糖分子的半乳糖一側(cè)連接 1~4 個(gè)半乳糖，生成低聚半乳糖 (galactooligosaccharide,GOS)；在乳糖水解產(chǎn)物半乳糖一側(cè)連接果糖，生成乳果糖（ lactulose）。 圖 1 乳糖水解機(jī)理 β半乳糖苷酶的分子 540kD， 為四聚體結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)基因?yàn)?LacZ(半乳糖苷酶 )，與 LacY（半乳糖苷透性酶）和 LacA（半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶）共同組成乳糖操縱子，并在特異的乳糖操縱系統(tǒng)中的阻遏物、操縱基因、啟動(dòng)子等的協(xié)同下，支配調(diào)節(jié) β半乳糖苷酶的合成。當(dāng)培養(yǎng)基中無(wú)誘導(dǎo)物質(zhì)時(shí)，每一細(xì)胞中雖然沒(méi)有幾個(gè)分子的 β半乳糖苷酶 ， 但一旦被誘導(dǎo)，則每一世代都能合成多達(dá)幾千個(gè)分子的酶。 β半乳糖苷酶可用于治療乳糖不耐癥。幾乎所有的哺乳動(dòng)物在斷奶后將失去分泌乳糖酶的能力，僅有極少數(shù)能在其腸道內(nèi)保持較高的乳糖酶活性。乳糖酶缺乏癥人群的乳糖攝入量超過(guò)其胃腸消化能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致乳糖代謝不完全。未被消化的乳糖在滲 透壓的作用下進(jìn)入腸內(nèi)被其他細(xì)菌分解代謝，會(huì)生成乳酸以及其他有機(jī)酸，導(dǎo)致消化不良和胃腸不適?？梢?jiàn)，未被消化的乳糖及有機(jī)酸的滲透作用是酸性腹瀉的誘發(fā)劑。此外，主要碳水化合物為乳糖的牛奶是一種全價(jià)營(yíng)養(yǎng)食東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 2 品，可以為人體提供蛋白質(zhì)、能量、鈣、磷和鉀等多種營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)人體健康。但是由于乳糖不耐癥的存在，很多人難以食用牛奶或其他乳制品，這極大地抑制了乳品行業(yè)的發(fā)展。 乳糖消化的程度取決于以下幾種因素：乳糖攝入量、在腸胃內(nèi)停留時(shí)間（由飲食時(shí)間決定）、 β半乳糖苷酶攝入量以及乳制品攝入量?？蒲腥藛T通過(guò)對(duì)乳糖不耐癥與乳糖攝入量關(guān) 系的大量研究，發(fā)現(xiàn)乳糖的攝入量與乳糖不耐癥的嚴(yán)重程度具有直接的關(guān)系：攝入較少劑量的乳糖（少于 12g 或一杯牛奶）不會(huì)導(dǎo)致乳糖不耐癥，而攝入較高劑量的乳糖（ 20g~50g）時(shí)則會(huì)導(dǎo)致較為嚴(yán)重的乳糖不耐癥。因此解決乳糖不耐癥最好的辦法是將乳糖從食物中去除，以無(wú)乳糖配方的形式供給人體。常見(jiàn)的去除乳糖的方法有大豆配方和水解配方，然而大豆配方對(duì)于體重小于 的早產(chǎn)兒其營(yíng)養(yǎng)成分遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，因此開(kāi)發(fā)可以分解乳糖的酶或微生物以水解配方解決乳糖不耐癥的方法成為研究的主要方向。 課題研究目的和意義 β半乳糖苷酶可以 有效降低乳制品中乳糖含量。在酸奶發(fā)酵中，向牛奶中接種保加利亞乳桿菌（ Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（ Streptococcus thermophilus）進(jìn)行發(fā)酵，可分解掉牛乳中 25~50%的乳糖，使牛奶中乳糖含量降至約 4%。乳酸菌定植于腸道內(nèi)，它們?nèi)阅艽x被攝入人體內(nèi)的乳糖。因此，乳酸菌可以廣泛用于各種乳品加工生產(chǎn)低乳糖制品。 采用篩選出的菌種進(jìn)行酸奶加工，驗(yàn)證其加工性能，掌握其工藝加工性能和應(yīng)用于乳品加工的潛力，從而將其應(yīng)用于乳品發(fā)酵 產(chǎn)品，降低乳糖含量，緩解人體普遍存在的乳糖不耐癥，擴(kuò)大乳品的消費(fèi)量。 具有較高 β半乳糖苷酶活性的乳酸菌能將牛奶中的乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，這對(duì)于乳品行業(yè)的發(fā)展具有很大的應(yīng)用潛力。 此外， β半乳糖苷酶可被加工成液態(tài)、藥劑或粉末狀形式的產(chǎn)品，用來(lái)治療乳糖不耐癥。這些都為產(chǎn) β半乳糖苷酶的開(kāi)發(fā)利用提供了潛在的發(fā)展市場(chǎng)。 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) 歷史上， β半乳糖苷酶的研究為微生物學(xué)的發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。國(guó)外對(duì) β第 1 章 緒 論 3 半乳糖苷酶的研究較早，許多研究工作主要集中在 β半乳糖苷酶在食品加工中的應(yīng)用。 1889 年 ，荷蘭生物學(xué)家 Beijerincek 第一次報(bào)道了 β半乳糖苷酶可水解乳糖。 1944 年 Whitter[1]就比較全面的討論了 β半乳糖苷酶的應(yīng)用。 1948 年 Caputto[2]等討論了通過(guò)大量培養(yǎng)和純化脆壁酵母（ Saccharimyces fragilis）生產(chǎn) β半乳糖苷 酶的方法。 法國(guó)的雅各（ Jacob）和莫諾德（ Monod） [3]通過(guò)對(duì)大腸桿菌 β半乳糖 苷酶的研究，于 1961 年提出了乳糖操縱子學(xué)說(shuō)，闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，使酶的生物合成可以按人們的意志加以調(diào)控，為研究其他生物的代謝調(diào)控提供