植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建與操作技術(shù)(已改無(wú)錯(cuò)字)
2023-02-04 04:57:18 本頁(yè)面
【正文】 沖洗 （轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)） 70%酒精表面消毒 20~60s 無(wú)菌水沖洗 消毒劑 處理 無(wú)菌水充分洗凈 備用 三、外植體的接種（無(wú)菌操作） 外植體的接種是把經(jīng)過(guò)表面滅菌后的植物材料切 碎或分離出器官、組織、細(xì)胞、轉(zhuǎn)放到無(wú)菌培養(yǎng)基上 的全部操作過(guò)程。 整個(gè)過(guò)程均需無(wú)菌操作。 （ 1）借助 接種用工具 將材料 切割 分離。 （ 2）將培養(yǎng)基放入超凈工作臺(tái)內(nèi)， 火焰灼燒培養(yǎng)基瓶口 ，然后打開(kāi)培養(yǎng)瓶口，置培養(yǎng)瓶為 斜角 ，避免灰塵雜菌落入瓶中。 （ 3）迅速將切割分離下的所需組織、細(xì)胞、器官，放入培養(yǎng)基上，及時(shí)蓋上瓶蓋。 （ 4）工具用后應(yīng)及時(shí)滅菌，避免 交叉污染 。 （ 5）工作人員操作時(shí)禁止不必要的談話。 ? 主要因素： 光照、溫度、濕度、氧氣 １、光照 光照強(qiáng)度 、 光質(zhì)以及光照時(shí)間 ， 對(duì)細(xì)胞的增殖 、 器官的分化都有很大影響 。 除特殊要求外 ， 一般都采用 日光燈 作光源 ， 根據(jù)不同植物或器官需要 ， 可以每天連續(xù)光照 1216小時(shí)， 也可每天光照 16小時(shí) ， 8小時(shí)黑暗 。 ２ 、 溫度 大所數(shù)植物最適溫度在 2332℃ 之間 。 培養(yǎng)室溫度是 25177。 2℃ 。 ３、濕度 培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)相對(duì)濕度常是 100%，培養(yǎng)室一般要求相對(duì)濕度保持在 7080%，相對(duì)濕度 過(guò)低影響培養(yǎng)物生長(zhǎng)和分化，應(yīng)向室內(nèi)噴灑水，以提高濕度；過(guò)高雜菌滋生，大量污染，應(yīng)及時(shí)地通風(fēng)除濕 。 ４、氧氣 接種時(shí)要有部分組織和空氣接觸 。 振蕩培養(yǎng) 是解決通氣的良好辦法 。 固體培養(yǎng)中 ， 如瓶塞不透氣 ， 培養(yǎng)物也不能生長(zhǎng) ， 要選擇通氣性好的培養(yǎng)瓶蓋 ， 增加可利用的氧氣 ， 迅速除去釋放出來(lái)的CO2， 有利于外植體外層細(xì)胞開(kāi)始分裂 。 ５ 、 pH值 不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適 pH值的要求也是不同的，大多在 5～，一般培養(yǎng)基皆要求 ，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。 外植體的成苗途徑有三種： （一）外植體 愈傷組織 完整植株 ① 同時(shí)長(zhǎng)芽和根 植株 ② 芽 根 植株 ③ 根 芽 植株 （二）外植體 胚狀體 植株 a) 器官上 b) 愈傷組織 c) 游離單細(xì)胞 d) 小孢子 誘導(dǎo)胚狀體比誘導(dǎo)芽 數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整 （ 三 ） 外植體 直接形成根與芽 植株 （ 一） 污染 病原菌 ： 細(xì)菌、真菌 ⑴ 細(xì)菌 污染：菌斑呈 黏液狀 ，接種后 12天發(fā)現(xiàn)。 ? 污染途徑：外植體帶菌；培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底 ? 操作人員未遵守操作規(guī)程 ⑵ 真菌 污染：污染部分長(zhǎng)有不同顏色的 霉菌 ，接種后 310天 發(fā)現(xiàn)。 ? 污染途徑：周圍環(huán)境不清潔；超凈工作臺(tái)過(guò)濾裝置失效；培養(yǎng)瓶的口徑過(guò)大 在組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象 污染的預(yù)防措施（ 6點(diǎn)） （１）防止材料帶菌的措施 ? 莖尖作外植體時(shí)，進(jìn)行 預(yù)培養(yǎng) （無(wú)糖）或暗培養(yǎng)，以 新抽嫩枝 作外植體。 ? 晴天 取材， 下午 取材，經(jīng)日曬可殺死部分細(xì)菌或真菌 ? 接種時(shí)除 去外部韌皮 組織，只接內(nèi)部的分生組織。 （ 2）外植體的滅菌 ? 多次 滅菌法：次氯酸鈉 無(wú)菌水 次氯酸鈉 ? 多藥劑 交替法：肥皂水 酒精 次氯酸鈉 無(wú)菌水 ⑶ 器皿與金屬器械的滅菌 ? 玻璃器皿可采用濕熱滅菌或 干熱 滅菌 ? 金屬器皿一般 火焰 滅菌， 也可干熱滅菌 （ 135140攝氏度滅菌 35h； 160170攝氏度滅菌 24h； 180200攝氏度滅菌 ） ⑷布質(zhì)制品的滅菌 濕熱滅菌 ⑸無(wú)菌操作室的滅菌 ? 2%新潔爾滅或 70%酒精擦拭（噴霧），紫外燈照射，定期甲醛和高錳酸鉀熏蒸。 ⑹ 嚴(yán)格按照無(wú)菌操作程序進(jìn)行 在干燥環(huán)境（如火焰或干熱空氣）進(jìn)行滅菌的技術(shù) a. 基因型 b. 外植體的生理狀態(tài) 幼年的材料、分生組織含醌類物質(zhì)較少 c. 培養(yǎng)基的成分 ① 無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高 ② 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)使用不當(dāng)， BA過(guò)多 ③ 培養(yǎng)條件不適宜， 溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng) d. 材料轉(zhuǎn)移時(shí)間 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起材料褐變 外植體體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞內(nèi)的 酚類 物質(zhì)氧化成棕褐色的 醌類 物質(zhì)，這種致死的褐變物向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，抑制其它酶的活性，影響外植體的分化，最后變褐死亡的現(xiàn)象。 影響因素 ⑴ 選擇 適宜的外植體 及 最佳培養(yǎng)基 ⑵提高 轉(zhuǎn)管 率 ⑶加 抗氧化劑 （抗壞血酸、 PVP、牛血清白蛋白等） ⑷加 活性炭 %活性炭 褐變的防止措施 ?組培苗外觀形態(tài)呈 半透明狀的生長(zhǎng)異?，F(xiàn)象 ?葉、嫩梢呈水晶透明或半透明 水浸狀 ；矮小 腫脹失綠 ；葉片皺縮卷曲、 脆弱易碎 ?葉表幾 無(wú)角質(zhì)層 蠟質(zhì)，沒(méi)有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織 ?體內(nèi) 含水量高 ，干物質(zhì)低， 光合能力和酶活性降低 ，組織畸形 ， 器官功能不全 ，分化能力降低 ?生根困難 ，很難繼續(xù)培養(yǎng)和移栽成活 ⑴ 激素 ： CTK濃度、比例過(guò)高（繼代次數(shù)太多） ⑵ 瓊脂 ：瓊脂濃度低（培養(yǎng)基太 “ 稀 ” ） ⑶ 溫度 ： ⑷ 光照 時(shí)間：光照太多、太強(qiáng) ⑸ 通風(fēng) 條件：氣體交換不良 (6)離子 水平：無(wú)機(jī)離子種類及比例不當(dāng) N 主要原因 ① 提高蔗糖和瓊脂濃度（提高 滲透勢(shì) ） ② 適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度，增加生長(zhǎng)素比例 ③ 適當(dāng)增加 Ca、 Mg、 Mn、 K、 P、 Fe、 Cu，降低 N（ 銨態(tài)氮 ）和 Cl（ 重選或改良培養(yǎng)基配方 ） ④ 增加 自然光照 ，控制光照時(shí)間 812h。 ⑤ 適溫 生長(zhǎng)，熱擊處理 ⑥ 使用透氣性好的封口膜 ⑦ 培養(yǎng)基中加入 青霉素 、 間苯三酚 、 根皮苷 或 多效唑 等 預(yù)防措施 一、試管苗的特點(diǎn) 試管苗的生態(tài)環(huán)境 ⑴高、恒溫 ? 試管苗整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中采用的是
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