植物組織培養(yǎng)實驗室的構(gòu)建與操作技術(shù)-wenkub
2023-02-04 04:57:18 本頁面
【正文】 是植物組織培養(yǎng)研究中最關(guān)鍵的部分 ? 分區(qū)： ? 準備室 ? 接種室：定期消毒，甲醛和高錳酸鉀蒸汽 ? 熏蒸 ? 目前，大多數(shù)實驗室采用超凈工作臺代替 ? ? ? 培養(yǎng)瓶 ? 廣口瓶 ? 三角瓶 ? 量筒 ? 燒杯 ? 容量瓶 ? 移液管 ? 培養(yǎng)皿 ? 試管 ? 鑷子 ? 解剖針 ? 接種針 ? 剪刀 ? 用具的洗滌： ? ? 1）新購置，用 1%稀 HCL浸泡一夜，肥皂水洗凈，清水沖洗，蒸餾水沖洗一遍 ? 2）用過，清水沖洗，蒸餾水沖洗一遍，干后備用 ? 3）已污染，高壓蒸汽滅菌 30min ? ? 擦凈油膩，熱肥皂水洗凈，清水沖洗，擦干備用 ? 用具的滅菌 ? 高溫滅菌：干熱滅菌 高壓蒸汽滅菌 ? 功能 接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所 （其設(shè)計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則）。 ? 實驗室的大小應取決于工作的目的和規(guī)模 ? 按 組織培養(yǎng)流程 來設(shè)計，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂 ? 利用 一 定的設(shè)備、器材和特殊的實驗室結(jié)構(gòu)設(shè)計，達到嚴格無菌的條件 一、實驗室設(shè)計與設(shè)備 ? ：根據(jù)實驗操作的性質(zhì)，進行適當?shù)姆謪^(qū) ? 清洗區(qū) ? 培養(yǎng)基配制區(qū) ? 試劑存放區(qū) ? 滅菌區(qū) (1)工作臺 (2)藥品柜 (3)冰箱 普通冰箱、低溫冰箱等。主要用于貯存母液、各種易變質(zhì)、易分解的化學藥品以及植物材料等。 ? 要求： ? 能控制光照和溫度 ? 保持相對的無菌環(huán)境 ? 有排風窗和換氣扇等培養(yǎng)室的換氣裝置 ? 有適宜的培養(yǎng)架，日光燈照明。 定義： 培養(yǎng)基 (culture medium)—— 根據(jù)植物生長所需營養(yǎng)成分，配制成的供植物生長的 人工制作 的營養(yǎng)物質(zhì)。 ?培養(yǎng)基大部分是水（ 固體培養(yǎng)基 約 75— 80%） ?天然水或自來水 不能 直接用于 培養(yǎng)基配制 ?原生質(zhì)體培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及分生組織培養(yǎng)一般應用 雙蒸水或超純水 。 ?濃度小于 ／ L的元素，有 Fe、 Cu、Zn等。 不同濃度會影響細胞的增殖分化，試管苗生長與繁殖濃度 23%，幼胚培養(yǎng) 46%，某些特殊培養(yǎng)中用 810%。 （ ３ ） 肌醇 （ 環(huán)己六醇 ） 促進 胚狀體和芽的形成 。） （６） 天然復合物（包括部分蛋白質(zhì)水解物） 其 成分比較復雜 ，大多含氨基酸、激素、酶等一些復雜化合物。 主要包括： 生長素、細胞分裂素、赤霉素 生長素 ／L 細胞分裂素 —10mg／ L。組織培養(yǎng)中常用人工合成 的生長素類物質(zhì) ?常用 IAA、 IBA、 NAA、 2,4D ?配成 1mg/ml的溶液貯于冰箱中 ? IAA天然生長素 ， 亦可人工合成 ， 其 活力較低 ， 是生長素中活力最弱的激素 ， 對器官形成的副作用小 ， 高溫高壓易被破壞 ， 受光也易分解 ? NAA啟動能力比 IAA高出 34倍 ， 可大批量人工合成 ，耐高溫高壓 ， 不易被分解破壞 ， 應用較 普遍 ? IBA促進 發(fā)根 能力較強 ?NAA和 IBA廣泛用于生根 ， 并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長 。 ?作用： ?誘導 芽 的分化 ?促進 側(cè)芽 萌發(fā)生長 ?促進細胞 分裂與擴大（莖增粗） ，抑制根的分化，延緩衰老 ?多用于誘導不定芽的分化、芽的增殖。 生長素 /細胞分裂素 高 利于根、愈傷組織的形成 適中 利于根芽的分化 低 有利于芽的形成 生長素與細胞分裂素同時使用有 協(xié)調(diào) 作用。 （２）活性炭 (active carbon) 常用的吸附劑，某些培養(yǎng)類型中，可以吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一些有毒物質(zhì)，有利于培養(yǎng)物的生長。 生根 培養(yǎng)基：誘導離體培養(yǎng)苗生根。 ? MS培養(yǎng)基 無機鹽和離子濃度較高 ， 硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高 。 ? N6培養(yǎng)基 成分較簡單 ， KNO3和 （ NH4） 2SO4含量高 。 一般母液配成比所需濃度高 10100倍。 （５）激素 每種單獨配成母液儲于冰箱，濃度一般為－ 1mg/ml。 ?有 代表性 的主要植物 ?優(yōu)良 的種質(zhì)、 特殊 的基因型 ?在植株生長的最適時期取材（花藥培養(yǎng)在 單核期 取材） ?大小一般在 （胚胎培養(yǎng)或脫毒在 下），材料太大易污染，材料太小難于成活。 整個過程均需無菌操作。 （ 4）工具用后應及時滅菌，避免 交叉污染 。 ２ 、 溫度 大所數(shù)植物最適溫度在 2332℃ 之間 。 ４、氧氣 接種時要有部分組織和空氣接觸 。 外植體的成苗途徑有三種： （一）外植體 愈傷組織 完整植株 ① 同時長芽和根 植株 ② 芽 根 植株 ③ 根 芽 植株 （二）外植體 胚狀體 植株 a) 器官上 b) 愈傷組織 c) 游離單細胞 d) 小孢子 誘導胚狀體比誘導芽 數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整 （ 三 ） 外植體 直接形成根與芽 植株 （ 一） 污染 病原菌 ： 細菌、真菌 ⑴ 細菌 污染：菌斑呈 黏液狀 ，接種后 12天發(fā)現(xiàn)。 （ 2）外植體的滅菌 ? 多次 滅菌法：次氯酸鈉 無菌水 次氯酸鈉 ? 多藥劑 交替法：肥皂水 酒精 次氯酸鈉 無菌水 ⑶ 器皿與金屬器械的滅菌 ? 玻璃器皿可采用濕熱滅菌或 干熱 滅菌 ? 金屬器皿一般 火焰 滅菌， 也可干熱滅菌 （ 135140攝氏度滅菌 35h； 160170攝氏
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