國家自然科學(xué)基金申請標(biāo)書的書寫(已改無錯字)
2022-09-12 21:14:48 本頁面
【正文】 — 以研究內(nèi)容為主線設(shè)計(jì)技術(shù)路線 — 分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系。 — 詳細(xì)地寫清楚每個具體步驟。 （ 1） 人晶狀體上皮細(xì)胞的獲得： 老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞取自白內(nèi)障患者手術(shù)中取出的前囊膜 （ 晶狀體上皮細(xì)胞緊貼于前囊膜 ） ， 直徑約 5mm。 正常晶狀體上皮細(xì)胞取自角膜移植供體眼的晶狀體 ， 在顯微鏡下撕下前囊膜 ， 直徑約8mm。 按文獻(xiàn)提供的方法去除晶狀體纖維細(xì)胞 ， 仔細(xì)清洗以去除血細(xì)胞污染 。 （ 2） 建立差異 cDNA文庫： 從 50例白內(nèi)障手術(shù)患者的前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組 ， 從 25例正常晶狀體前囊膜上取下的晶狀體上皮細(xì)胞作為對照組 ， 利用改良的消減雜交技術(shù) [19， 20]， 獲得差異表達(dá)的 cDNA， 并建立文庫 。主要的實(shí)驗(yàn)流程如下： 正常晶狀體上皮細(xì)胞 白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞 Promega PolyATtract174。 System 1000 mRNA分離 mRNA分離 oligodT18反轉(zhuǎn)錄 ntech Capfinder方法反轉(zhuǎn)錄 cDNA Biotin21dUTP pendingcDNA 隨機(jī)引物 PCR 雜交 Sephacryl S400柱 除鹽及小片段 鏈親和素 生物素磁性分離 除去雜交體及過量正常晶狀體上皮細(xì)胞 cDNA “ 長距離” PCR 目的 cDNA的特異擴(kuò)增 克隆、鑒定、轉(zhuǎn)化 建立差異基因文庫 （ 3）制備基因芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因： ① 基因芯片的制備： ……… ② 白內(nèi)障相關(guān)基因的篩選： …… （ 4）白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)分析： ① 序列測定： ... ... ② 序列的計(jì)算機(jī)分析： ... ... ③ 獲得全長基因： ... ... （ 5）基因轉(zhuǎn)染： ① 培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染： …… ② 在體晶狀體的轉(zhuǎn)染： …… 可行性分析 對實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的分析 理論分析 研究手段方法分析 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 對相關(guān)條件的分析 所用特殊實(shí)驗(yàn)材料（試劑）的分析 對所具備的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析 對項(xiàng)目組成員搭配及其運(yùn)用技術(shù)方法的能力分析 (1)關(guān)于建立差異 cDNA文庫： 老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞是處在不同狀態(tài)下的細(xì)胞，細(xì)胞基因表達(dá)的改變是細(xì)胞蛋白功能等改變的基礎(chǔ)。尋找這些有差異的基因是探索細(xì)胞功能、狀態(tài)變化原因的突破口。利用的消減雜交技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因的有效方法。改良的消減雜交技術(shù)是我們研究組成員建立的方法，應(yīng)用此方法已經(jīng)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中 5個為新基因，這一研究成果進(jìn)一步證實(shí)了該方法 的可操作性，而且我們在運(yùn)用此方法過程中也積累了較豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此，本研究利用這一方法從兩種狀態(tài)的晶狀體上皮細(xì)胞中篩選差異表達(dá)的基因并建立 cDNA文庫是可行的。 創(chuàng)新性 存在問題 ： 對創(chuàng)新點(diǎn)提煉不夠 把運(yùn)用新技術(shù)、新方法理解為創(chuàng)新 與研究目標(biāo)、研究內(nèi)容相混淆 對創(chuàng)新的理解 ： 原始創(chuàng)新：填補(bǔ)空白或修改傳統(tǒng)的理論 發(fā)明創(chuàng)造新技術(shù)、新方法 跟蹤創(chuàng)新：補(bǔ)充、完善現(xiàn)有理論 修改、完善現(xiàn)有技術(shù)方法（ 1＋ 1＞ 2） 提煉方法： 用逆向思維方法提煉創(chuàng)新點(diǎn) （ 1）基因篩選方法上的創(chuàng)新： 首次采用改良的消減雜交技術(shù)建立白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫，并制備相應(yīng)的基因芯片，利用此基因芯片篩選出老年性白內(nèi)障相關(guān)基因 。 上述兩種方法的有機(jī)結(jié)合使我們能快速、準(zhǔn)確、定性、定量地獲得多個白內(nèi)障相關(guān)基因 。通過分析這些基因的結(jié)構(gòu)、研究它們的功能，揭示老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞變化的分子生物學(xué)機(jī)制，為防治白內(nèi)障提供新的思路。 年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果 年度研究計(jì)劃：
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