【正文】 對(duì)應(yīng)的限制性 還可用雜交法篩選重組質(zhì)粒。5. PCR法五、注意事項(xiàng)1. DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10100倍。2. 在連接帶有粘性末端的DNA片段時(shí)，DNA濃度一般為210mg/ml，在連接平齊末端時(shí)，需加入DNA濃度至100200mg/ml。3. 連接反應(yīng)后，反應(yīng)液在0℃儲(chǔ)存數(shù)天，80℃儲(chǔ)存2個(gè)月，但是在20℃冰凍保存將會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。4. 粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，在連接粘性末端時(shí)，反應(yīng)溫度以1016℃為好，平齊末端則以1520℃為好。5. 在連接反應(yīng)中，如不對(duì)載體分子進(jìn)行去5’磷酸基處理，便用過(guò)量的外源DNA片段（25倍），這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機(jī)會(huì)。6. LB選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當(dāng)抗生素時(shí)，攜有載體DNA的轉(zhuǎn)化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。該產(chǎn)品篩選效果同藍(lán)白斑篩選，且價(jià)格低廉。但需及時(shí)挑取白色菌落，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，白色菌落會(huì)逐漸變成微紅色，影響挑選。7. Xgal是5溴4氯3吲哚bD半乳糖（5bromo4chloro3indolylbDgalactoside）以半乳糖苷酶（bgalactosidase）水解后生成的吲哚衍生物顯藍(lán)色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside），為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達(dá)。8. 在含有Xgal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱34小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。實(shí)驗(yàn)十四 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一、目的掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備二、概 述在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主。三、 材料及試劑（一）、材料1. E. coli DH5α菌株（Rˉ,Mˉ,Ampˉ）2. pBS質(zhì)粒DNA: 購(gòu)買或?qū)嶒?yàn)室自制3. eppendorf管。（二）、設(shè)備恒溫?fù)u床電熱恒溫培養(yǎng)箱臺(tái)式高速離心機(jī)無(wú)菌工作臺(tái)低溫冰箱恒溫水浴鍋制冰機(jī)分光光度計(jì)微量移液槍。（三）、試劑1. LB固體和液體培養(yǎng)基2. Amp母液3. 含AmpLB固體培養(yǎng)基:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲(chǔ)存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板4. : CaCl2(無(wú)水,分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。5. 含15%: CaCl2(無(wú)水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。四、 操作步驟（一）、受體菌的培養(yǎng)1. 從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種于35ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右,直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。2. 將該菌懸液以1:1001:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)23小時(shí)至OD600 ＝。（二）、感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( CaCl2 法)1. 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。2. 棄去上清,冰上放置1530分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。3. 棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。4. 感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份,貯存于70℃可保存半年。（三）、轉(zhuǎn)化1. 從70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。2. 加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過(guò)50ng,體積不超過(guò)10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。3. 42℃水浴中熱休克90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻35分鐘。4. 向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。5. 將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)1624小時(shí)。6. 同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照:a) 對(duì)照組1: 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒(méi)有菌落出現(xiàn)。b) 對(duì)照組2: 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。（四）、計(jì)算轉(zhuǎn)化率1. 統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。2. 轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：1) 轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積2) 轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg)3) 感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對(duì)照組２菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積／涂板菌液體積4) 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)五、注意事項(xiàng)1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來(lái)控制。DH5α菌株的OD600 ,細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。5. 。但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣。有的轉(zhuǎn)化效率高，需將轉(zhuǎn)化液進(jìn)行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉(zhuǎn)化效率低,涂板時(shí)必須將菌液濃縮(如離心),才能較準(zhǔn)確的計(jì)算轉(zhuǎn)化率。 分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)８ 實(shí)驗(yàn)十五 PCR及RTPCR一、目的掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 及逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)的基本方法二、原理PCR用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反應(yīng)中，使用兩段寡核苷酸作為反應(yīng)的引物。一般情況下，這兩段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補(bǔ)，而這兩段模板序列又分別位于待擴(kuò)增的兩側(cè)。反應(yīng)時(shí)它包括三個(gè)基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA 片段在94℃下解鏈。 (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì)。(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最適溫度下,以目的DNA ,理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA 擴(kuò)增一倍（圖4）,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA 又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)2535 輪循環(huán)就可使DNA 擴(kuò)增達(dá)106 倍。RNA的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）是以RNA為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcrip－tion, RT）與PCR，可用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于10個(gè)拷貝的特異DNA，為RNA病毒檢測(cè)提供了方便；并為獲得與擴(kuò)增特定的RNA互補(bǔ)的cDNA提供了一條極為有利和有效的途徑。RNA擴(kuò)增包括兩個(gè)步驟：①在單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ)鏈cDNA；②加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最后擴(kuò)增靶DNA。在RTPCR中關(guān)鍵步驟是RNA的逆轉(zhuǎn)錄，cDNA的PCR與一般PCR條件一樣。由于引物的高度選擇性，細(xì)胞總RNA無(wú)需進(jìn)行分級(jí)分離，即可直接用于RNA的PCR。但RTPCR對(duì)RNA制品的要求極為嚴(yán)格，作為模板的RNA分子必須是完整的，并且不含DNA、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。RNA中即使含有極微量的DNA，經(jīng)擴(kuò)增后也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；蛋白質(zhì)未除凈，與RNA結(jié)合后會(huì)影響逆轉(zhuǎn)錄和PCR；殘存的RNase極易將膜板RNA降解掉。硫氰酸胍（GaSCN）CsCl法或酸性硫氰酸胍酚氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法為佳，適合一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒（Avian myeloblastosis virus, AMV）和莫洛尼鼠類白血病病毒（Moloney murine leukemia virus, MOMLV）的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）。一般情況下用MoMLVRT較多，但模板RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，可改用AMVRT，因后者最適溫度為72℃，高于MoMLVRT的最適溫度（37℃），而較高的反應(yīng)溫度有助于消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。一步法擴(kuò)增（one step amplification）是為了檢測(cè)低豐度mRNA的表達(dá)，利用同一種緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后的PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡(jiǎn)化，所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢測(cè)非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測(cè)出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA。該法還可用于低豐度mRNA的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及特異cD－NA的克隆，并有可能與Taq酶的測(cè)序技術(shù)相組合，使得自動(dòng)反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測(cè)序在一個(gè)試管中進(jìn)行。三、材料（一）、儀器1. DNA擴(kuò)增儀，亦稱PCR儀2. 臺(tái)式高速離心機(jī)3. 電泳儀、電泳槽4. Pharmacia Biotech公司的ImageMaster VDS凝膠成像儀（二）、塑料器皿Eppendorf管、Tip頭（三）、其他物品1. 微量加樣槍(?10 ul、5?40 ul和40?200各1支)2. Eppendorf管架（四）、DNA模板含有靶序列的DNA可以單鏈或雙鏈形式加入PCR混合液。雖然DNA的大小并不是關(guān)鍵的因素，但當(dāng)使用極高分子量的DNA(如基因組DNA)時(shí)，若用切點(diǎn)罕見(jiàn)的限制酶(Sal I 或Not I)先進(jìn)行消化，則擴(kuò)增效果更好，閉環(huán)靶序列DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA，因此用質(zhì)粒作反應(yīng)模板時(shí)最好先將其線狀化，但這也不是非常必要。模板DNA中靶序列的濃度因情況而異，而且往往非實(shí)驗(yàn)者所能控制。盡管如此，仍值得按已知靶序列量遞減(1ng、)的方式設(shè)置一組對(duì)照反應(yīng)，以檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度是否符合要求。（五）、試劑1. 10PCR緩沖液(不含MgCl2)2. 5mmol/LdNTPs,3. Taq DNA聚合酶(5u/ul)4. MgCl2，25mmol/L5. 5TBE電泳緩沖液6. 10g/L溴化乙錠7. 1%?2%瓊脂糖凝膠(濃度視待擴(kuò)增的DNA片段大小而定)8. 兩對(duì)套疊式引物四、操作步驟(一)、以DNA為模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)1. 按以下次序， Eppendorf管中混合：1) 模板DNA(100mg/L) 2) 10PCR緩沖液 3) 4) 引物(5’端,30pmol/L) 5) 引物(3’端,30pmol/L) 6) MgCl2(25mmol/L) 7) Taq 酶(5u/ul) 。8) 用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積至50 ul2. 將溶液混勻，15 000r/min離心10秒鐘。3. 用50 ul輕礦物油覆蓋于反應(yīng)混合液上，防止樣品在重復(fù)加熱－冷卻過(guò)程中蒸發(fā)(這步可省略)。4. 按以下方法進(jìn)行擴(kuò)增。典型的變性、退火和延伸條件如下：循環(huán) 變性 退火 延伸首輪循環(huán) 94℃5 min 55℃1min 72℃1min后續(xù)循環(huán) 94℃1min 55℃1min 72℃1min末輪循環(huán) 94℃1min 55℃1min 72℃7min5. 末輪循環(huán)后不再變性，15 000r/min 離心2min，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入另一小管中，置20℃保存。6. 從反應(yīng)混合液中取出擴(kuò)增產(chǎn)物DNA進(jìn)行凝膠電泳、Southern雜交或DNA序列測(cè)定分析。（二）、以mRNA為模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)1. 設(shè)置合成cDNA第一鏈的反應(yīng)：1) 4擴(kuò)增緩沖液 2) 3) Oligo(dT)1218(100mg/L) 4) RNAinhibitor 20