[醫(yī)藥衛(wèi)生]基因擴增技術(shù)pcr(已改無錯字)
2023-04-22 06:52:28 本頁面
【正文】 可加 110%二甲基亞砜 （ DMSO） ， 使模板易于解鏈和引物特異性的結(jié)合 。 若不出 DNA擴增帶 ， 用持家基因引物做 PCR，首先排除模板問題 ， 在依次尋找其它原因 ，引物不特異 、 退火溫度過高 、 Mg2+濃度不合適或試劑出現(xiàn)問題等 。 對很難擴增的片段可考慮用下游引物反轉(zhuǎn)錄。 對長片段的策略。 RTPCR實驗的策略 PCR污染的對策 隔離不同的實驗操作區(qū) ， 將提取 RNA操作區(qū) 、 引物 分裝區(qū)、 PCR操作區(qū)及 PCR產(chǎn)物分析區(qū)分開； 分裝試劑 ， 把試劑分裝成小份 ， 在冰箱中保存 。 目的 是為了減少重復取樣所造成的污染； 改進實驗操作 ， 實驗時戴一次性手套 ， 加樣中要避免反應(yīng)液的飛濺 。 在操作多份樣品時 ， 要制備標準混合液 ， 將各組分混勻后再分到不同的管 ， 這樣可以減少 操作污染，并且提高微量加樣的精確度。 PCR污染的對策 設(shè)置對照 陽性對照：用已知的陽性模板； 陰性對照：加無關(guān)的或不加模板 DNA。 重復實驗：為防止因各種原因引起的實驗 誤差，應(yīng)進行反復驗證，以確 保實驗結(jié)果的重演性。 污染的處理 ? 酸處理：用 1M的稀鹽酸擦拭或浸泡污染器 件，可促進 DNA脫嘌呤； ? 紫外燈照射： UV波長一般選擇 254/300 nm，照射 30分鐘即可 。 紫外照射可促使 DNA形成二聚體 ， 阻止鏈的延伸 。 紫外照射對長片段 的 DNA有效，對短片段效果不大。 巢式 PCR(nested PCR) 對于極微量的靶序列 ， 一次擴增很難取得滿意的效果 ， 則可用巢式 PCR進行多次擴增 。 引物之間的關(guān)系如下圖所示： 引物 1和引物 4進行第一次擴增 ， 其產(chǎn)物作為模板 ， 用引物 2和 3作為再次 PCR的引物 。 如果一次 PCR產(chǎn)物在凝膠上有可見的條帶 ， 二次 PCR只能用第一次 PCR產(chǎn)物的 1/104105為模板 。 實時定量熒光 PCR 實時 PCR（ real time PCR） 是 1996年以來發(fā)展起來的一種新技術(shù)。 熒光定量 PCR技術(shù)的整個操作過程在完全封閉的狀態(tài)下進 行，有效的避免了 “ 假陽性 ” 的實驗結(jié)果。 熒光探針的使用提高了檢測靈敏度和特異性 ， 并能夠準確 定量樣品的 模板數(shù) 。 PCR擴增后不需進行電泳等后處理 ， 而直接定量樣品模板 數(shù) ， 使其具有分析時間短 ， 重復性好 、 省力 、 低費用等優(yōu) 點。 TaqMan 探針 A TaqMan 探針同時帶有熒光報道子和淬滅子 ， 無熒光信 號發(fā)生； B 在退火階段 ， 引物和探針同 時與模板結(jié)合； C 在延伸階段 ， Tag 酶將探針水解 ， 報道子被切割 ， 使得熒光信號釋放 ， 熒光信號的強弱與模板的量成正比 。 熒光染料摻入法 某些染料能夠特異性地結(jié)合到 雙鏈 DNA上 ， 而不結(jié)合到單鏈 DNA上 ，而且與雙鏈 DNA結(jié)合后的染料發(fā)光強度會明顯增加 ， 檢測結(jié)合到雙鏈 DNA上的熒光染料發(fā)出的熒光可 實時監(jiān)測 PCR擴增產(chǎn)物的數(shù)量 。 SYBR Green I是一種結(jié)合于 DNA雙螺旋 小溝 中的熒光染料 。 其最大吸收波長約為 497nm， 最大發(fā)射波長約為 520nm。 優(yōu)點 ： 由于它與所有的雙鏈 DNA相結(jié)合，不因模板不同而特別定制通用性好， 且價格相對較低。 由于一個 PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料
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