【正文】 ~500mg的填料。,第七十四頁，共一百二十一頁。qǔ)裝置和操作過程,第七十五頁，共一百二十一頁。 鍵合硅膠固相提取的一般操作步驟如下: ① 以適當強溶劑濕潤固相萃取柱使其溶劑化。ngt224。 ③將溶于弱溶劑常是緩沖溶液中的樣品加到固相提取柱上。 ⑤用強度較高的溶劑洗脫待測組分,收集洗脫液,直接或適當濃縮后進行色譜分析。,選擇(xuǎnz233。ngzh236。 （1）溶質(zhì)的極性： 分析物的極性與固定相極性非常相似時得到分析物的最佳保留。 例如萃取碳氫化合物（非極性）要采用反相柱（非極性）。,第七十七頁，共一百二十一頁。ngj236。yuē)。如果溶劑太強得不到保留或保留很弱。,第七十八頁，共一百二十一頁。tā)因素,其他還應該考慮(kǎolǜ)以下幾點： ①分析物在極性或非極性溶劑中的溶解度； ②分析物有無可能離子化，從而決定可否用離子交換固定相； ③分析物有無可能與固定相形成共價鍵； ④不要的組分與分析物在固定相結合點上的競爭程度。,基質(zhì)(jī zh236。 所用的填充料一般(yībān)為C18或C8，樣品和填充料的比例通常為1:4。,MSPD是一種在SPE的基礎上改進后的樣品處理(chǔlǐ)方法，相對于SPE法，它的優(yōu)點在于： 依靠機械剪切力、C18鍵合相的去垢效應和巨大的表面積，使樣品結構破碎并且在填料表面均勻分散，濃縮了傳統(tǒng)的樣品前處理中所需的樣品勻化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程，避免了樣品勻化、轉溶、乳化、濃縮造成的待測物損失，而且固定相處理樣品的比容量大，提取凈化的效率較高。,第八十一頁，共一百二十一頁。n)技術,柱切換技術是色譜分析中處理復雜樣品的方法之一。i xi224。此法常用一種長3~5cm，填以粒徑25~40181。 進樣后流動相Ⅰ攜帶樣品進入色譜柱，被測組分保留于預柱上，而雜質(zhì)則隨流動相Ⅰ作為廢液 流出。,第八十二頁，共一百二十一頁。n)法的優(yōu)點,①操作簡單，全自動化，含蛋白樣品可直接進樣或簡單地沉淀蛋白離心后即可進樣； ②分析結果精密度高，一般無需內(nèi)標，進樣體積一般為0.2~1.0mL（血漿、血清因黏度較大，需稀釋后進樣），在線處理全過程由計算機程序控制，每個樣品在同一預柱的相同條件下處理，分析結果的RSD一般小于5%。nb249。,第八十三頁，共一百二十一頁。tǐ)萃?。⊿FE）,超臨界流體萃取是一種較新的樣品預處理技術，以超臨界流體（常用二氧化碳）作為提取溶劑。tǐ)和液體之間，而且與溫度、壓力和流體組成有關。密度越低,其性質(zhì)越接近氣體。,第八十四頁，共一百二十一頁。r yǎng hu224。n)萃取流程圖,二氧化碳液體由高壓泵輸入處于恒溫的預熱管中轉化為超臨界流體并進入樣品管進行萃取。ng)填料的吸收管內(nèi),最后被收集瓶收集。,第八十五頁，共一百二十一頁。 壓力的變化可以改變超臨界流體對物質(zhì)的溶解度,因此采用程序升壓就可以把溶解度從大到小的物質(zhì)先后從樣品中分離出來。)被萃取物溶解度的大小,可以采用動態(tài)、循環(huán)和靜態(tài)不同的操作方法。 靜態(tài)法是將樣品在流體中浸泡一段時間后,再使被萃取物從樣品中分離出來。,第八十六頁，共一百二十一頁。qǔ)（SPME）,固相微萃取的原理與SPE不同，是建立在待測物在固定(g249。ng)相和水相之間達成平衡分配的基礎上。 固相微萃取采用熔融石英光導纖維為固相吸附劑,將其浸泡在樣品溶液中時,樣品中的有機物被吸附在光導纖維的表面。,第八十七頁，共一百二十一頁。)光導纖維不被折斷的作用。光導纖維的吸附量和原始液的濃度有一定的關系。,第八十八頁，共一百二十一頁。qǔ)法被廣泛地應用于樣品的分析中。 已有大量的應用文獻報道。,免疫(miǎny236。noafinity chromatograplly, IAC)是以抗原抗體的特異性、可逆性免疫結合反應為原理的色譜技術,其基本過程為將抗體與惰性基質(zhì)(如珠狀瓊脂糖、鍵合相硅膠)偶聯(lián)制成固定相,裝柱。bi233。 IAC的最顯著優(yōu)點在于對待測物的高效、高選擇性保留能力,特別適用于復雜樣品痕量組分的凈化與富集。,第九十一頁，共一百二十一頁。)技術,第三節(jié) 樣品衍生(yǎn shēnɡ)化技術,第九十二頁，共一百二十一頁。 衍生化在色譜分析中的作用歸納起來主要有以下幾點: ①提高檢測靈敏度。 ③適合進一步做化合物的結構(ji233。u)鑒定。,第九十三頁，共一百二十一頁。 優(yōu)點：衍生化試劑、反應時間和反應條件的選擇都不受色譜條件的限制,衍生化后的樣品能用各種預處理方法進行純化和濃縮,也不需要附加特殊的儀器設備。d236。 當衍生化試劑的分子量相對大時,其引入還可能減小組分間由于分子大小差別而產(chǎn)生的色譜保留行為的差別。,(2)柱后衍生(yǎn shēnɡ)化,柱后衍生(yǎn shēnɡ)化是樣品經(jīng)色譜分離后,使衍生化試劑與色譜流出組分在系統(tǒng)內(nèi)進行反應,然后檢測衍生物。 缺點：需要附加輸液泵、混合室和反應器等裝置,由于柱出口至檢測器間有較長的流程,可能發(fā)生色譜峰展寬。,實現(xiàn)(sh237。n)柱后衍生化必須滿足下列條件:,①衍生化試劑足夠穩(wěn)定,對檢測器的響應可以忽略,不產(chǎn)生干擾。 ③衍生化試劑與色譜柱流出液的速度要匹配,混合迅速且均勻,以免產(chǎn)生噪聲。xū)迅速和重現(xiàn)性好,反應器設計要合理,以盡可能減少峰展寬。,二、HPLC柱后衍生(yǎn shēnɡ)化,(1)柱后衍生化裝置 柱后衍生化使色譜柱至檢測器之間增加(zēngjiā)了混合器與反應器及多個連接部件,這些都將產(chǎn)生柱外效應,導致峰展寬。 高效率混合器 管式反應器：螺旋型、編織型,第九十七頁，共一百二十一頁。 zi)內(nèi)就是一個固相衍生化器。 固相反應劑的種類很多,包括氧化型、還原型、基團轉移型和催化劑型,可適應各種衍生化反應的需要。 大分子只能與擔體表面的試劑作用,而小分子可以進入擔體的所有反應部位,因此當有大分子干擾物存在時,只有痕量大分子發(fā)生衍生化,不干擾小分子待測物的檢測。,特點(t232。 ②過量衍生化試劑不會進入檢測器,降低了檢測(jiǎn c232。 ③反應速度取決于溶液接觸的表面積(填料粒度),由于填料粒度小,因而反應速度快。 ⑤不需額外的混合器、管線、接頭等,減少了峰展寬因素。,(3)固定化酶衍生(yǎn shēnɡ)化,最早期把一種酶連接于螺旋管的內(nèi)壁就是最早最簡單的酶反應器。 優(yōu)點：酶反應的專一性很強,因此方法的選擇性很高。 缺點：固定化酶的工作(gōngzu242。 如果溶劑及其pH不合適,就可能使酶迅速失去活性。,固相衍生(yǎn shēnɡ)化的一種特殊型式,第一百頁，共一百二十一頁。)器檢測(jiǎn c232。 只需在色譜柱與檢測器間 安裝一個光源和一段反應管。 檢測器：紫外可見檢測器、熒光檢測器或電化學檢測器。,成功的光化學衍生化必須(b236。 ②色譜洗脫液對上述波長的光應該透明。 ④光反應足夠迅速。,第一百零二頁，共一百二十一頁。o)特點：,①價格低廉,光可能是最便宜的衍生化試劑。 ③在恒流條件下,有恒定和重現(xiàn)的動力學參數(shù)。,第一百零三頁，共一百二十一頁。柱后裂解能對色譜峰進行化學結構鑒定,這一點與MS的作用(zu242。ng)相似。 濃集器主要有四類,即噴射分離器、燒結玻璃分離器、多孔膜和高聚膜。,(3)柱后反應器,有一種含有鎳硅藻土催化劑的微型反應器,加熱至425℃ 時,能允許(yǔnxǔ)氫氣自由通過,而其他組分則裂解成甲烷和水。 氫反應器能使色譜峰中含有鹵素或氮的組分還原成氫鹵酸和氨,然后進行庫侖檢測或電導檢測。,第一百零五頁，共一百二十一頁。 pǔ)的化學衍生化,須滿足的要求： ①反應能迅速、定量地進行,而且對反應條件要求不苛刻。 ③過量的衍生化試劑或反應的副產(chǎn)物不干擾樣品的分離和檢測。,第一百零六頁，共一百二十一頁。j236。 其次還要考慮樣品基質(zhì)和可能存在的干擾物質(zhì)的影響,有時可能要進行適當?shù)姆蛛x或凈化后才能進行衍生化反應。ng)的色譜系統(tǒng)是否與之匹配。,可見(kěji224。 利用親核取代反應可以將伯胺和仲胺轉化成芳香(fāngxiāng)衍生物,常用的化學衍生化試劑是苯甲酰氯、芳基磺酰氯、異硫氰酸酯和硝基苯。n),衍生化試劑：高度共軛的芳香化合物,第一百零八頁，共一百二十一頁。ow249。 最常用的衍生化試劑是苯甲酰甲基溴和萘甲酰甲基溴。 (1)苯甲酰甲基溴和萘甲酰甲基溴類試劑 (2)芳香胺類試劑,第一百零九頁，共一百二十一頁。 羥基化合物很容易(r243。)轉化成酯,最常用的紫外可見衍生化試劑是酰氯,還有異氰酸苯酯(PIC)。,D、羰基(tānɡ jī)化合物的衍生化,2,4二硝基苯肼(2,4DNPH)是較早應用于酮、醛、羰基甾體和糖等羰基化合物的可見紫外衍生(yǎn shēnɡ)化試劑,產(chǎn)物為苯腙化合物,其反應式為:,第一百一十一頁，共一百二十一頁。ngguāng)衍生化,HPLC的熒光檢測器靈敏度比紫外檢測器高得多,適合半痕量分析。 熒光衍生物的激發(fā)波長和發(fā)射波長往往與試劑本身不同,因此熒光衍生化反應既可在柱前也可在柱后進行。,第一百一十二頁，共一百二十一頁。ngguāng)衍生化試劑,(1)磺酰氯類試劑 (2)氯甲酸酯類試劑 (3)異硫氰酸酯 (4)熒光胺 (5)含有(h225。ngguāng)衍生化,第一百一十三頁，共一百二十一頁。ngguāng)衍生化,D、羰基化合物的熒光衍生化,(1)肼類試劑：丹磺酰肼 (2)鄰苯二胺及其類似試劑,7甲氧基香豆素3碳酰疊氮+伯醇/仲醇,第一百一十四頁，共一百二十一頁。ng)。 氧化電化學檢測法是優(yōu)先考慮的方法,因此具有(或能生成)前兩類基團的衍生化試劑更為常用。,衍生(yǎn shēnɡ)化試劑,(1)胺類和氨基酸的電化學衍生化 ① 酰氯和酸酐類試劑 ② 二戊鐵類試劑 ③ 其他(q237。,五、用于氣相色譜的衍生(yǎn shēnɡ)化反應,GC柱前衍生化主要是將難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定化合物通過化學反應轉變成易揮發(fā)和穩(wěn)定的化合物,然后再進行GC分析。ng),此外酯化、?；?、烷基化、裂解、縮合和成環(huán)反應等也是常用的反應。,第一百一十七頁，共一百二十一頁。ng),含有質(zhì)子性基團(jī tu225。,第一百一十八頁，共一百二十一頁。ng),羧酸的極性較強,常與GC的“惰性”固定相發(fā)生非特異性作用,產(chǎn)生拖尾峰。jiē)分析羧酸。,羧酸(suō suān)類化合物衍生化,第一百一十九頁，共一百二十一頁。ng),?；芙档土u基、氨基、巰基的極性,改善這些化合物的色譜性能,酰化還能增加氨基酸、糖類等化合物的揮發(fā)性,也能使兒茶酚胺等易于氧化的化合物的穩(wěn)定性增強。 ?；噭┯腥悾乎｛u、酸酐(suāngān)和有反應活性的?；锶缫阴＿溥?應根據(jù)需要進行選擇。,內(nèi)容(n232。ng)總結,第六章 獸藥殘留檢測技術。以結合狀態(tài)(zhu224。i)存在的藥物大多存在于尿中,但也存在于肝臟和血液中