【正文】 a useful reference for transplantation of traditional high performance puting to ：與使用GPU作通用計(jì)算相關(guān)運(yùn)用的研究實(shí)例比比皆是，且大多數(shù)研究將使用GPU來(lái)提高運(yùn)用程序的執(zhí)行性能為研究中心，但是至于怎樣衡量GPU運(yùn)行時(shí)的成本卻很少有人提及。實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果說(shuō)明所提算法能夠相對(duì)精確地評(píng)估GPU執(zhí)行性能從而為傳統(tǒng)的高性能計(jì)算的在GPU中的移植提供了一個(gè)實(shí)用性的參考。在對(duì)MET單克隆抗體抗性和抗體對(duì)化學(xué)抑制劑旁路抗性（反之亦然）一無(wú)所知時(shí)，酪氨酸激酶抑制劑對(duì)MET的抗性機(jī)制就已經(jīng)被提出。我們培養(yǎng)生成抵抗抗體的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)這種抗性是由于MET基因大量復(fù)制擴(kuò)增和它的受體顯著表達(dá)而來(lái)。值得注意的是MVDN30抗體的抗性細(xì)胞是MET耐受細(xì)胞對(duì)MET酪氨酸激酶抑制劑也很敏感。在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)MET酪氨酸激酶抑制劑存在抗性的細(xì)胞仍然對(duì)MVDN30抗體的作用敏感?？s略語(yǔ)：MVDN30單價(jià)DN30，TKEs—酪氨酸激酶抑制劑，HGF—肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，MAPK—有絲分裂原活化蛋白激酶 可以抑制一個(gè)特定的目標(biāo)分子化合物的靶向治療法開(kāi)辟了治療癌癥的新道路。靶向治療依賴(lài)于“癌基因沉癮”的概念。臨床試驗(yàn)中的特定抑制劑的發(fā)展給腫瘤細(xì)胞的“Achille’s heel”的識(shí)別提供支持（溫斯坦和喬，2006）。因此，最關(guān)鍵的就是要發(fā)現(xiàn)對(duì)治療抵抗的機(jī)制并且找到繞過(guò)它們的方法。這個(gè)觀察發(fā)現(xiàn)許多腫瘤沉溺其中使得蛋白激酶成為了治療癌癥的理想目標(biāo)（巴塞爾加，2006。在臨床診斷中主要使用一種較小的激酶抑制劑和單克隆抗體來(lái)抑制酪氨酸激酶。它們能有效地瞄準(zhǔn)膜結(jié)合位點(diǎn)和細(xì)胞內(nèi)的激酶并且很容易在體內(nèi)擴(kuò)散。這些分子的優(yōu)點(diǎn)在于它們具有很高的特異性。除此之外，很多針對(duì)于其他目標(biāo)的單克隆抗體正處與發(fā)展和試驗(yàn)階段。在和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合后，MET活化并啟動(dòng)一個(gè)復(fù)雜的生化程序，這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)作“浸潤(rùn)性上長(zhǎng)”。很多研究結(jié)果表明MET在人類(lèi)的許多腫瘤中具有活性，并且它與對(duì)直接激酶療法的持續(xù)抗性密切相關(guān)。在前期設(shè)置得到的基本結(jié)果，幾種特定的多目標(biāo)的酪氨酸激酶抑制劑和直接針對(duì)于MET或者HGF的抗體已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。對(duì)MET TKIs的抗性可能是由于一些機(jī)制，比如MET基因擴(kuò)增，過(guò)度表達(dá)，MET點(diǎn)突變，MET平行路徑的激活和KRAS基因的擴(kuò)增機(jī)制。我們以前報(bào)道過(guò)主要針對(duì)細(xì)胞外的部分MET的抑制性單克隆抗體的研究進(jìn)展。因此，DN30結(jié)合到MET后的結(jié)果是使其變成可溶性的誘餌MET并且蛋白水解酶會(huì)講解MET激酶。設(shè)計(jì)了這樣一個(gè)過(guò)程就是因?yàn)镈N30的結(jié)合使得MET激酶部分活化并且導(dǎo)致抗體介導(dǎo)的受體同源二聚體化和單價(jià)Fab片段失去競(jìng)爭(zhēng)活性的一個(gè)過(guò)程。值得注意的是，MVDN30抗性細(xì)胞還會(huì)一直對(duì)MET TKIs產(chǎn)生耐受性和敏感性。我們還表明對(duì)MET TKIs 有抗性的細(xì)胞也對(duì)MVDN30敏感，所以，MVDN30和MET TKIs 對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用是相互促進(jìn)的。GTL16 是一種實(shí)驗(yàn)室里的克隆胃癌細(xì)胞系。對(duì)MVDN30有抗性的EBC1細(xì)胞可以通過(guò)一個(gè)逐步的方法培養(yǎng)得到，由Sigma Tau Ramp。親代細(xì)胞用10 mg/ml 的MVDN30治療約一個(gè)月，直到生成的R10細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生抗性為止，R10抗性細(xì)胞又用逐步增加濃度的MVDN30治療。大約兩個(gè)月可以分離到R20抗體抗性細(xì)胞，四個(gè)月可以分離到R80抗體耐受細(xì)胞。該細(xì)胞系的遺傳身份通過(guò)一個(gè)短的串珠狀重復(fù)序列（STR）識(shí)別，這段序列在2013年7月再次重復(fù)出現(xiàn)。 Johnson)和p38MAP激酶抑制劑SB203580(Merck).用Trizol 試劑提取得到的RNA被檢測(cè)到利用多文士病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成，cDNA可以用實(shí)時(shí)的利用電源帶動(dòng)的綠色PCR混合的PCR 技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，根據(jù)制造商的說(shuō)明下面的MET和ACTIN特異性引物要用到： hMET ex 19 Fw: 50AGTTTACCACCAAGTCAGATGTGT30。hACTIN Fw: 50GGAGGAGCTGGAAGCAGCC30。MET的mRNA的成倍增加和EBC1中MET基因的大量復(fù)制以及MVDN30抗性細(xì)胞歸一化然后被認(rèn)可。在細(xì)胞裂解前2小時(shí)把MET TKI JNJ38877605加入到指定的地方。antivinculin(V9131)from Sigma and antibactin(I19 sc1616)from Santa Cruz IgG HRPPeroxidase antibodies were from ，或MVDN30抗性的EBC1細(xì)胞(R80)都被平鋪在60mm的盤(pán)里。然后，這些細(xì)胞在不含L蛋氨酸但有500mmMCIL甲硫氨酸S35(脈沖)（易標(biāo)記）的DMEM培養(yǎng)基中處理20分鐘。之后，用免疫沉淀法（IP）在1ml細(xì)胞裂解液中進(jìn)行測(cè)定（裂解緩沖液：1% TritonX100存在下，20 mM Tris鹽酸，5毫米EDTA，10% V / v甘油，150 mM NaCl補(bǔ)充蛋白磷酸酶抑制劑）通過(guò)使用抗Met ICD dq13單克隆抗體，而IP法利用抗Met ECD do24單克隆抗體對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)2毫升上清液進(jìn)行。免疫沉淀物中的蛋白就會(huì)被8% SDSPAGE 分開(kāi)，然后轉(zhuǎn)移到3mm的紙上，80度，48小時(shí)后蛋白質(zhì)的放射性就會(huì)在投影膜上留下印記。沒(méi)經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞控制在藥物載體存在的條件下生長(zhǎng)。對(duì)結(jié)合在EBC1WT,R20,R80細(xì)胞質(zhì)膜上的MET進(jìn)行免疫熒光著色，這些細(xì)胞要提前在有或沒(méi)有MVDN30存在的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。用于檢測(cè)的細(xì)胞要在PBS中用2%FBS洗滌并且在室溫下用抗MET ECD DO24 mAb(100 ng/ml)著色20分鐘。作為陰性對(duì)照，將不含初級(jí)抗MET抗體的細(xì)胞進(jìn)行染色。EBC1 WT 細(xì)胞能穩(wěn)定地在兩種不同量的慢性病毒顆粒編碼的MET cDN轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括1mg(MET254。)(MET254。254。作為對(duì)照，WT細(xì)胞用含有空載體病毒顆粒感染。在感染48小時(shí)后接種細(xì)胞用于生物化學(xué)分析。如先前所述，MET的蛋白印跡分析和磷酸化的MET蛋白水平和對(duì)感染細(xì)胞的mRNA的表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR分析一樣子細(xì)胞感染72小時(shí)后進(jìn)行評(píng)估。如果使用一個(gè)藥品從藥物劑量來(lái)說(shuō)要比混合使用的IC50約高10倍左右，雙重增加濃度可以用于單藥使用和組合使用。使用相互排他性假設(shè)計(jì)算CI值（藥物作用機(jī)理的不同，）軟件，可上線的網(wǎng)站：，和繪制功能的FA（由這兩種藥物的組合影響系統(tǒng)分?jǐn)?shù)）。同一個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行兩尾t檢驗(yàn)分析至少有三種生物學(xué)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的結(jié)果。MET TKIs或者M(jìn)VDN30對(duì)EBC1細(xì)胞里的MET具有強(qiáng)烈的破壞它們生存和上長(zhǎng)的能力的作用（圖A~C）。為了產(chǎn)生抗MVDN30的細(xì)胞，我們采用逐步暴露EBC1原代細(xì)胞不方法來(lái)增加抗體的濃度，并且獲得抗不同劑量抗體的細(xì)胞系（圖1b；約的分步方法詳見(jiàn)材料和方法部分）。在有MVDN30存在的抗性細(xì)胞的生長(zhǎng)速度一直和WT細(xì)胞差不多（圖1C）。這種反應(yīng)減少了細(xì)胞表面的MET的大量表達(dá)，抑制了MET的活性和受體介導(dǎo)的生物學(xué)活性。與抗性細(xì)胞的生化分析相反的是顯示了在相同劑量抗體存在的情況下，MET也會(huì)磷酸化并且在質(zhì)膜上的大量的MET蛋白明顯高于保存在相同條件下的WT細(xì)胞（圖1D,E）。所有的數(shù)據(jù)表明，抗EBC1細(xì)胞的MVDN30并不是通過(guò)一種足以消除它的結(jié)構(gòu)的活性的方法來(lái)下調(diào)MET，如圖1D,E所示，用MVDN30處理抗性細(xì)胞致使MET大量減少這種減少比處于同等條件下觀察的WT細(xì)胞中的減少更明顯。于是，我們?cè)u(píng)估了是否是抗性細(xì)胞中脫落的MET胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）對(duì)抗體的反應(yīng)被抑制了。當(dāng)對(duì)去處抗體24小時(shí)后的抗性細(xì)胞中MET的表達(dá)和活化進(jìn)行評(píng)估時(shí)，我們觀察到MET總量強(qiáng)烈增加特別是結(jié)合在細(xì)胞膜上的形式（圖2B和圖1）。在脈沖代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中也觀察到了相似的結(jié)果：比起WT細(xì)胞，抗性細(xì)胞合成更多的MET和MVDN30來(lái)促進(jìn)MET ECD 釋放并大量增加（圖2E）。圖2F所示在抗性細(xì)胞中隨著MVDN30劑量是增加減少了大量MET在細(xì)胞膜上的表達(dá)（圖2A）和磷酸化(圖2B)。圖1抗MVDN30的EBC1細(xì)胞分子表征。對(duì)未經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞(100%)177。(B)在指定濃度抗體的條件下培養(yǎng)72小時(shí)的EBC1 WT細(xì)胞或產(chǎn)生MVDN30抗性的細(xì)胞(R10, R20, R40, R80)。 。與未經(jīng)過(guò)處理的WT細(xì)胞(100%)177。(D)在有指定劑量MVDN30抗體存在的條件下處理24小時(shí)的EBC1WT ,EBC1R20和R80細(xì)胞的蛋白印跡。(A)在存在或不存在MVDN30的環(huán)境下培養(yǎng)24小時(shí)的EBC1 WTR20和R80細(xì)胞的上清液中MET ECD的蛋白印跡。紐蛋白作為控制基礎(chǔ)(C)在 EBC1 WT, R20 and R80 細(xì)胞中有或沒(méi)有（24小時(shí)去除）MVDN30的條件下在質(zhì)膜上結(jié)合的MET的熒光強(qiáng)度的箱圖。(D)在用MVDN30處理（24h）的EBC1WT R20和R80 細(xì)胞中和抗性細(xì)胞（圖2 D）中觀察到的MET總蛋白水平和MET ECD 的蛋白印跡.(E)在有或沒(méi)有MVDN30存在下的EBC1WT和R80細(xì)胞里的MET(來(lái)源細(xì)胞裂解液，上面)和MET ECD（來(lái)源與細(xì)胞上清液，底部）的用脈沖追蹤代謝蛋白標(biāo)記法的免疫沉淀分析。未經(jīng)過(guò)處理的WT細(xì)胞（左圖）或者用20 mg/ml(100%)處理的R20（右圖）統(tǒng)計(jì)結(jié)果(***P , *P )。我們懷疑這可能是由于增加的啟動(dòng)子活性或更高的mRNA的可用性，因?yàn)槟阄NA的負(fù)控制微分表達(dá)了。然后我們?cè)u(píng)估了基因擴(kuò)增的情況是因?yàn)镸ET大量復(fù)制是對(duì)激酶抑制劑存在抗性的機(jī)制。當(dāng)分析MET的mRNA水平時(shí)，我們觀察到MET的過(guò)度表達(dá)是WT細(xì)胞的2~3倍，達(dá)到了MET正常表達(dá)細(xì)胞(A549 and HEK293T)的60~90倍。我們觀察到，MET的mRNA以2~3倍的速度劇增，這與在存在MVDN30的條件下細(xì)胞的活性有關(guān)（圖3D）。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嗜MET的EBC1細(xì)胞變得有抗性是因?yàn)镸ET的進(jìn)一步擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)從而來(lái)阻止有效的抗體介導(dǎo)的對(duì)MET活性的抑制。如圖4a,b所示，抗MVDN30的EBC1細(xì)胞在有抗體(20 mg/ml for R20 and 80 mg/ml for R80)存在的條件下生長(zhǎng)情況顯示了當(dāng)用MET激酶抑制劑JNJ38877605(10 nM or 250 nM)處理時(shí)，細(xì)胞活性的降低和MET磷酸化作用的減弱。從抗性細(xì)胞的培養(yǎng)基中去除MVDN30會(huì)導(dǎo)致MET的表達(dá)增加（圖2B），我們研究了過(guò)度表達(dá)的生化效應(yīng)。這些細(xì)胞的蛋白印跡分析表明，隨著時(shí)間的推移逐漸增加了磷酸化（圖4D）。除此之外，在沒(méi)有MVDN30存在的條件下培養(yǎng)的抗性細(xì)胞中的p38 MAPK會(huì)受到一種小分子SB203580 的抑制使得細(xì)胞活性得以恢復(fù)（圖3）。為了證明當(dāng)去除MVDN30后過(guò)多的MET信號(hào)使細(xì)胞凋亡是正確的，我們用低劑量的MET YKI處理抗性細(xì)胞讓其充分減少但不會(huì)完全抑制MET活性（圖4）?？傊@些結(jié)果表明，MVDN30抗性細(xì)胞都是嗜MET細(xì)胞并且它們的繁殖和生存都有藥物依賴(lài)性。單獨(dú)或在有非常低劑量的MVDN30存在的條件下（~，從10倍以下的IC50開(kāi)始），我們用逐步增加MET抑制劑JNJ38877605的方法來(lái)處理EBC1 WT細(xì)胞。如圖5C所示，~20 nm ~。如圖5A、B所示，多藥效應(yīng)分析表明了 EBC1 and GTL16 WT細(xì)胞的CI值都小于1，從而表明了JNJ38877605和 TKI和MVDN30聯(lián)合治療可以有效地減少嗜MET細(xì)胞的活性，劑量明顯低于單獨(dú)一種藥物治療的藥量。顯而易見(jiàn)，這種耐藥性機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究。即使對(duì)關(guān)于癌癥是怎樣產(chǎn)生耐藥性抗體的了解很少，一些現(xiàn)象提示用抗EGFR 和抗HER2抗體治療的病人體內(nèi)有耐藥機(jī)制的建立。除此之外，最近的研究還證明了EGFR或HER2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可以分別繞過(guò)西妥昔單抗或曲妥單抗的抑制；這些包括EGFR配體水平增加，MET RTK的擴(kuò)增或過(guò)度表達(dá)，下游或平行激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。它的失調(diào)可能是由于不同的機(jī)制包括過(guò)度表達(dá)，基因擴(kuò)增，激活突變和受體介導(dǎo)的刺激自分泌或旁分泌的增加。MET的酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域中激活突變位點(diǎn)已經(jīng)在散發(fā)腫瘤中確定。在原發(fā)性腫瘤中由基因擴(kuò)增引起的MET過(guò)度表達(dá)是少見(jiàn)的，但在肺癌和結(jié)腸癌中變得抗靶向其它RTKs治療的情況更頻繁。然而，用小劑量的激酶抑制劑延長(zhǎng)對(duì)嗜MET細(xì)胞的處理會(huì)導(dǎo)致二倍抗性的出現(xiàn)，這種機(jī)制可以被維持比如MET擴(kuò)增或突變,KRAS的擴(kuò)增或EGFR家族成員的活化。這一現(xiàn)象的機(jī)理解釋依賴(lài)于染色體外的MET復(fù)制的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，造成了一種癌癥對(duì)治療的適應(yīng)性程序。我們觀察到蛋白的增加平行下來(lái)是METmRNA增加的2~3倍。WT EBC1細(xì)胞和大多數(shù)嗜MET細(xì)胞一樣可以表達(dá)比正常表達(dá)細(xì)胞的約30倍多的MET；因此，在抗性細(xì)胞中2~3倍的增加可以引起MET水平比那些正常細(xì)胞中的MET水平高60~90倍。除此，作為抗性細(xì)胞識(shí)別增加的脫落的MET導(dǎo)致了MET ECD在細(xì)胞內(nèi)的累積，并且脫落的ECD可以和細(xì)胞膜上的MVDND30結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合從而減少抗體的抑制效應(yīng)。有趣的是，當(dāng)MET變得非?；钴S的時(shí)候，可以通過(guò)增加在MVDN30存在下的MET 的表達(dá)在這種適宜的有利的環(huán)境下來(lái)使其對(duì)藥物的去除效果減弱。信號(hào)過(guò)量可導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激（在我們的情況下，通過(guò)p38 MAPK活化）導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Das Thakur做了一個(gè)類(lèi)似的觀察，這個(gè)人證明了人類(lèi)黑色素瘤移植提供的抗藥性，藥物的去除使耐藥腫瘤的腫瘤消退是由于依賴(lài)BRAT信號(hào)過(guò)量。這在嗜MET細(xì)胞中也被證明是正確的，無(wú)論是抗MVDN30還是抗TKIs的EBC1細(xì)胞都表現(xiàn)出藥物依賴(lài)性并且去除藥物會(huì)致死細(xì)胞。此外，我們表明，抗體治療是活躍的細(xì)胞提供的抗酪氨酸激酶抑制劑，相反，TKI治療耐mvdn30細(xì)胞有效。這種發(fā)現(xiàn)在臨床上受到關(guān)注，因?yàn)樗砻髁擞每筂ET的抗體治療病人可能是沒(méi)用的，病人的對(duì)TKIs的抗性是由于MET表達(dá)的增加或者是它們的毒性限制了TKI的劑量。值得注意的是，盡管是幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，在用MET TKI和MVDN30治療時(shí)我們并沒(méi)能過(guò)培養(yǎng)出抗性