【正文】 Gln、ValSerPro、LeuGlnPro、LeuAlaTyr和ValAlaTyr)；來源于無花果乳液的肽類AlaValAspProIleArg，LeuTyrProValLys和LeuValArg均有抗高血壓作用；從人參、茶葉、銀杏葉等植物內(nèi)也分離出很多用于心血管疾病的小肽。比如stiernberg等發(fā)現(xiàn)一個合成肽(TP508)肽能促進傷口血管的再生，加速皮膚深度傷口的愈合。Carron等證實其篩選的2個合成肽能抑制破骨細胞對骨質(zhì)的重吸收。具有強烈鎮(zhèn)痛活性，其活性高于嗎啡。內(nèi)嗎啡肽1是迄今所知對μ阿片受體親和力和選擇性最高的生物活性肽。 診斷用多肽多肽在診斷試劑中最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細胞、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體，多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強，且易于制備，因此裝配的檢測試劑，其檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低，易于臨床應用。使用的多肽抗原大部分是從相應致病體的天然蛋白內(nèi)分析篩選獲得，有些是從肽庫內(nèi)篩選的全新小肽。阿斯巴甜由苯丙氨酸與天冬氨酸為原料合成，其甜度為蔗糖的200倍，可供糖尿病患者等忌糖者食用，且熱量低，可用作減肥保健品。我國人口眾多，食品消費量數(shù)值驚人，甜味劑需求潛力很大。這些食品感官肽能夠模擬、掩蓋和增進口感。而風味肽則可作為加工食品的風昧和香味的前體，起到增強風味的作用。食品感官肽在我國生產(chǎn)和應用剛剛起步，但市場潛力巨大，值得進一步研究與開發(fā)。其中分子量小于20kDa的多肽因子在代謝過程中易由腎小球濾過；通過腎小管時多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并從尿中排出，因而半衰期短。近幾年各國學者主要從化學修飾、基因融合、點突變以及制劑改造等方面著手進行長效多肽藥物的研究。非酶催化的脫酰胺反應與環(huán)境條件和多肽結(jié)構(gòu)有關(guān)，提高pH值、升高溫度都有利于脫酰胺反應的進行。 氧化：多肽溶液易氧化的主要原因有兩種，一是溶液中有過氧化物的污染，二是多肽的自發(fā)氧化。氧分壓、溫度和緩沖溶液對氧化也都有影響。由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷裂，尤其是AspPro和AspGly肽鍵。 消旋：除Gly外，所有氨基酸殘基的α碳原子都是手性的，易在堿催化下發(fā)生消旋反應。 β消除：β消除是指氨基酸殘基中β碳原子上基團的消除。在堿性PH下易發(fā)生β消除，溫度和金屬離子對其也有影響。在變性狀態(tài)，多肽往往更易發(fā)生化學反應，活性難以恢復。通常中間體的溶解度低，易于聚集，形成聚集體，進而形成肉眼可見的沉淀。 增加多肽藥物穩(wěn)定性的方法 改進多肽的自身結(jié)構(gòu)： 定點突變 通過基因工程手段替換引起多肽不穩(wěn)定的殘基或引入能增加多肽穩(wěn)定性的殘基，可提高多肽的穩(wěn)定性。例如白介素2是一條133個氨基酸組成的多肽鏈，其中呈游離狀態(tài)的Cys125易形成錯誤的二硫鍵配對或形成分子之間的二聚體影響活性和穩(wěn)定性，將Cys125用Ser或Ala取代后生物活性比正常高1倍。K2tPA保留了tPA13及176～527位氨基酸的肽段，缺失K1區(qū)、E區(qū)和F區(qū)使之成為單鏈多肽，無糖基側(cè)鏈，半衰期延長4～5倍；TNKtPA突變體是將tPA 103位Thr變成Asn；117位Asn變成Gln；Lys296His297Arg298Arg299替換成4個Ala，該突變體血清清除速率降低4倍左右，已獲得美國FDA批準進入市場。 化學修飾 選擇合適的修飾方法和控制修飾程度可提高多肽的生物活性，提高熱穩(wěn)定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延長體內(nèi)半衰期。PEG是惰性、兩親、不帶電荷的柔性聚合物，分子量隨聚合程度而變化(1～50kDa)，有線性和支鏈兩種構(gòu)型，其中線性單甲氧基聚乙烯醇(mPEG)已經(jīng)FDA批準作為許多藥物的安全載體。目前mPEG修飾已應用于40多種不同蛋白的修飾如豬血清白蛋白(BSA)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、白介素2(IL2)等。這可能是由于PEG大分子在蛋白分子周圍形成一層外殼阻礙了免疫細胞與蛋白的接觸保護了蛋白，掩蓋了蛋白酶識別位點避免蛋白酶降解的發(fā)生，但同時也使蛋白的活性位點受到影響。Yamasaki等在PEG修飾重組人粒細胞集落刺激因子(rhGCSF)中發(fā)現(xiàn)修飾位點的多少(即1分子rhGCSF與幾分子PEG結(jié)合)對半衰期的延長方面并無多大影響，但修飾位點少活性損失就相對少一些；為保持蛋白的生物活性，采取位點特異性修飾即將蛋白功能結(jié)構(gòu)域中易與PEG結(jié)合的氨基酸殘基換成功能相似不干擾蛋白與PEG結(jié)合的氨基酸殘基如賴氨酸替換成精氨酸。隨著研究的不斷深入，不少PEG修飾蛋白藥物已經(jīng)上市或者進入臨床。多糖和白蛋白作為化學修飾劑也有成功范例：用于治療血栓的葡聚糖鏈激酶已在俄羅斯上市；白蛋白已作為多種蛋白藥物的載體，白蛋白SOD半衰期由5min提高到6h；白蛋白GH半衰期由5min提高2～3h，將rhGCSF通過異雙功能試劑聚乙二醇與白蛋白共價偶聯(lián)，使GCSF的體內(nèi)清除速度降低約6倍。但是化學修飾是完全隨機的，帶來的產(chǎn)物不均一性及藥物活性的降低似乎是不可避免的，為此有人提出采用酶法進行位點特異性修飾。 基因融合通過基因融合技術(shù)增加多肽和蛋白藥物分子量或改變與受體的親和性等原理延長藥物半衰期。日本Green Cross公司酵母表達的HSA 已完成Ⅲ期臨床實驗和規(guī)?；a(chǎn)的準備，臨床實驗證明酵母表達的HSA與天然的HSA在效果和安全性方面完全一致。美國Yeh 等將CD4 與HSA 融合表達，HASCD4 融合蛋白在小鼠體，內(nèi)半衰期較CD4 延長140 倍，使其半衰期與HSA 相似。用于治療血小板凝集的73個氨基酸的毒液肽Barbourin 與白蛋白融合后清除率較Barbourin 明顯降低且活性保持較好，水蛭素融合白蛋白后不僅延長了藥效，且增強了其生物學活性。Chamow等制備了CD4/IgG，包括CD4的V1，V2結(jié)構(gòu)域，人Ig重鏈鉸鏈區(qū)及Fc段，已進入Ⅰ期臨床試驗。據(jù)報道scFv片斷具有抗蛋白酶降解的作用，與L2天冬酰胺酶融合后L2天冬酰胺酶半衰期由2h延長至9h。除了利用蛋白載體基因融合外有些細胞因子之間融合也可以實現(xiàn)藥效的延長，促血小板生成素(Tpo)富糖基化的C端在體內(nèi)可能有穩(wěn)定分子、延長半衰期以提高分子效率的作用，汪治清等構(gòu)建了紅細胞生成素(Epo)Tpo融合蛋白，初步試驗結(jié)果顯示Epo半衰期由8h增至12h。融合蛋白基因穩(wěn)定性高，可調(diào)控表達且制備簡單，產(chǎn)物均一，對蛋白、多肽藥物活性影響小等，是目前研究長效多肽、蛋白藥物的良好途徑。糖和多元醇在低濃度下迫使更多的水分子圍繞在蛋白質(zhì)周圍，因而提高了多肽的穩(wěn)定性。此外表面活性劑如SDS、Tween、Pluronic，能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。另外，水含量降低可使多肽的變性溫度升高。 五、藥理性預適應預適應是指預先給予某種損傷性刺激后，機體組織器官對這些有害刺激產(chǎn)生的耐受性或適應性。缺血預適應有兩個時相，即早期保護和延遲保護。缺血預適應的信號轉(zhuǎn)導途徑涉及“觸發(fā)物質(zhì)中介物質(zhì)效應子”。雖然缺血預適應能有效防治心肌缺血再灌注損傷，但這種保護作用的獲得是以心肌細胞缺血為代價的。已證明多種藥物如硝酸甘油、單磷脂A、腺苷、ATP 敏感性鉀通道( KATP通道) 開放劑、嗎啡、川芎嗪等具有誘導預適應作用，并將藥物替代缺血刺激所產(chǎn)生的預適應稱為藥理性預適應。 1．硝酸甘油 內(nèi)源性NO與缺血預適應的心臟保護密切相關(guān)。硝酸甘油是經(jīng)典抗心絞痛藥，在體內(nèi)代謝釋放NO 而發(fā)揮保護作用。Elliot 等在犬和家兔實驗中證明，MLA 能誘導延遲保護，其作用與促進誘生型一氧化氮合酶(iNOS)表達，促進NO 合成，最終活化KATP通道而產(chǎn)生心肌保護作用。3．腺苷 腺苷是介導缺血預適應的重要內(nèi)源性活性物質(zhì)。雙嘧達莫能抑制內(nèi)皮細胞對腺苷的攝取和代謝，增高血中腺苷濃度，雙嘧達莫預適應能顯著減輕肝臟缺血再灌損傷。腺苷作用于受體，激活PKC，開放KATP通道，縮短動作電位時程，減少Ca2+內(nèi)流，產(chǎn)生心肌保護作用。KATP通道是缺血預適應信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要效應子。5．嗎啡與阿片肽類藥物 心肌缺血預適應與內(nèi)源性阿片樣肽有關(guān)，這已被納洛酮(非選擇性阿片受體阻斷劑) 能取消心肌缺血預適應所證實。DPDPE(δ阿片受體激動劑) 能增強小鼠對低氧的耐受力，該作用可被BN2TX(選擇性δ1阿片受體拮抗劑) 取消，但不被naltrindole (δ2阿片受體拮抗劑) 取消，提示阿片類藥物的預適應是由δ1受體介導而非δ2受體介導。 (第三軍醫(yī)大學 張海港 李曉輝)18 / 1