轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要技術(shù)及其應(yīng)用研究-閱讀頁
2025-07-13 06:21本頁面
【正文】 文庫中的大量克隆進(jìn)行隨機(jī)測序后，統(tǒng)計與基因x的mRNA相對應(yīng)的EST數(shù)目，就可估計原先mRNA群體中的mRNA x的豐度。White等人稱這種以cDNA 測序來估計基因表達(dá)水平的方法為“電子Northern”(electronic Northern) 或“數(shù)字Northern”(digital Northern)。 應(yīng)用（1）基因組物理圖譜的繪制通過已知的EST序列設(shè)計引物對基因組BAC文庫進(jìn)行PCR能產(chǎn)生擴(kuò)增條帶的那個克隆就是EST在染色體上的位置，這個EST就可以被定位在幾號染色體上，進(jìn)而亞定位至染色體的某個區(qū)段。EST與STS（特定序列位點）在基因組作圖上有相同的作用，而且EST位點還直接與一個表達(dá)的基因位置相對應(yīng)。由于EST 序列是全世界很多實驗室隨機(jī)產(chǎn)生的，所以屬于同起來, 通過EST assembly 程序在EST 庫中搜索與之高度重疊的EST ，并將它們組裝成一致序列(consensus sequence) ，再用它檢索數(shù)據(jù)庫并逐次放寬匹配條件，重復(fù)組裝以獲得盡可能長的或全長cDNA 序列。但該技術(shù)也有局限，如果參數(shù)限制條件太低，很可能會得到錯誤結(jié)果；而參數(shù)條件限制太高，就可能沒有結(jié)果。（3）分離鑒定新基因?qū)δ骋惶禺惤M織或某一生長發(fā)育階段的cDNA文庫進(jìn)行隨機(jī)的部分測序，得到大量EST，將這些EST作查詢項在dbEST中進(jìn)行同源查找，同時將由EST推出的氨基酸序列作為查詢項在PIR中查找類似物，很就可以識別這些基因到底是什么基因；對于那些在以上數(shù)據(jù)庫中沒有找到類似物的EST，再把它們置于6個ORF下，翻譯出推定的氨基酸序列，將可能的氨基酸序列作為查詢項，在PIR數(shù)據(jù)庫中查找類似物，果有類似物，就認(rèn)為這個EST代表著這個蛋白的基因。對于那些在dbEST和PIR數(shù)據(jù)庫中都沒有類似物的EST，就可能是完全新的基因，需要進(jìn)一步識別和研究它。篩選的大致步驟為：EST重疊群的組裝；通過對大量重復(fù)的EST進(jìn)行序列比較，識別出候選SSR或SNP；對候選SSR或SNP進(jìn)行確認(rèn)。除了以上用途外，EST還在基因結(jié)構(gòu)分析（內(nèi)含子、外顯子識別）、基因表達(dá)及重組蛋白表達(dá)的分析中具有重要作用。RNAi 指外源性雙鏈RNA (dsRNA )能抑制細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的基因的表達(dá)。該技術(shù)最大的優(yōu)點就是可以獲得大規(guī)模的缺失突變體，為基因功能的研究提供了很好的研究工具，同時EST作為序列標(biāo)簽，可以很好地實現(xiàn)表型相關(guān)的基因克隆。隨著“后基因組”時代的到來，生物信息學(xué)在基因功能研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。EST數(shù)據(jù)庫為新基因的發(fā)現(xiàn)和基因表達(dá)研究提供了大量的信息和分析材料，也為DNA分子標(biāo)記的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。第一，大量EST序列信息整理的問題。植物基因組極其龐大，某一特定組織在特定時期的基因表達(dá)頻率各不相同。 原理和方法（1）基因表達(dá)系列分析技術(shù)(SAGE)SAGE技術(shù)是由Velculescu 等人[15]在 1995 提出，是一種可以定量并同時分析大量轉(zhuǎn)錄本的方法。SAGE 技術(shù)大致理論依據(jù)有兩點：第一，來自cDNA特定位置的一段913bp 的序列能夠包含有足夠的信息作為確認(rèn)唯一一種轉(zhuǎn)錄物的SAGE標(biāo)簽（9個堿基能夠分辨49個不同轉(zhuǎn)錄物）；第二，將來自不同 cDNA 的 SAGE 標(biāo)簽集于同一個克隆中進(jìn)行測序，就可以獲得連續(xù)的短序列SAGE標(biāo)簽，而這些SAGE標(biāo)簽可以顯示對應(yīng)的基因的表達(dá)情況。2）將收集的 cDNA 片段分為兩等份，分別加上含有標(biāo)簽酶（一種Ⅱ類限制酶，在距離識別位點大概 20 堿基處酶切 DNA 雙鏈）識別位點的接頭 A 和 B。4）用錨定酶酶切 PCR 富集的產(chǎn)物，得到雙標(biāo)簽片段，將 1050個標(biāo)簽序列置于一個克隆中進(jìn)行測序。為了適應(yīng)不同的試驗需要，目前出現(xiàn)了許多新型 SAGE 技術(shù)，如 superSAGE、robust longSAGE、PCRSAGE、SARSAGE等[17]。（2）大規(guī)模平行測序技術(shù)（MPSS）MPSS 技術(shù)是由 Brenner 等[18]在 2000 年建立的以測序為基礎(chǔ)的大規(guī)模高通的基因分析技術(shù)。MPSS 技術(shù)的方法包括兩個基本過程：第一，cDNA 片段、標(biāo)簽和微球體的結(jié)合；第二，測序反應(yīng)。2）將消化并純化后的片段克隆到含有32bp TAG 序列的標(biāo)簽（tag）載體中，這樣就可以通過與標(biāo)簽中序列互補(bǔ)的引物擴(kuò)增插入的片段，再通過酶切，獲得線性化的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物（含有 cDNA 序列和特異性的 32bp 標(biāo)簽序列）。4）測序反應(yīng)過程，將接頭、BbvⅠ酶（ⅡS 型限制性酶，可以酶切距離識別位點913個堿基）識別位點和識別序列（recognition sequence）結(jié)合在微球體上的 cDNA 片段上末端的4個游離堿基，加入 16 種不同的熒光標(biāo)記的解碼器探針與接頭雜交，獲得相應(yīng)的熒光信號，以讀取這4個堿基的序列，經(jīng) BbvⅠ酶消化后，在 cDNA 片段上再次產(chǎn)生4個堿基末端，去掉酶切序列后可以進(jìn)行下一輪的分析，這樣經(jīng)過5次反應(yīng)就可以測出每一個微球體上長度為 17bp 的cDNA序列。（3）RNA 測序技術(shù)(RNAseq)該技術(shù)首先將細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫(利用最新的SMS技術(shù)可略去這一步，直接對RNA進(jìn)行測序[20])，然后將cDNA文庫中的DNA隨機(jī)剪切為小片段(或先將RNA片段化后再轉(zhuǎn)錄)，在 cDNA 兩端加上接頭利用新一代高通量測序儀測序，直到獲得足夠的序列，所得序列通過比對(有參考基因組)或從頭組裝(denovoassembling，無參考基因組)形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜。同時，由于SAGE技術(shù)的靈敏度很高，可以檢測出低豐度表達(dá)的基因，所以通過該技術(shù)不僅能夠很全面的獲得基因表達(dá)的數(shù)目、表達(dá)豐度等信息。SAGE還可用于在不同生理狀態(tài)、不同環(huán)境、或不同生長階段的細(xì)胞或組織的基因表達(dá)圖譜構(gòu)建，對不同狀態(tài)下基因表達(dá)水平的定量或定性比較。這些上調(diào)基因，尤其那些是在正常組織中不表達(dá)或少量表達(dá)的基因，很可能成為有用的腫瘤診斷和預(yù)測指標(biāo)或潛在的治療位點。MPSS所獲得的基因序列可提供PCR引物，可通過比較Gen Bank EST 數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行基因定位，也可轉(zhuǎn)化為分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜等等，因此該技術(shù)可廣泛用于動植物體分類學(xué)和遺傳學(xué),功能基因組學(xué), 蛋白質(zhì)組學(xué)等研究。 不足和展望EST 技術(shù)[21,22]，雖然可以直接檢測cDNA序列，但這種方法的檢測量較低、價格貴并且一般很難達(dá)到定量的分析目的；SAGE技術(shù)[23,24]和MPSS技術(shù)[18,25]克服了EST術(shù)的缺點，具備高通量、精確性、數(shù)字化信號等特點，但大多數(shù)依賴于價格昂貴的Sanger測序技術(shù)，并且短的標(biāo)簽序列的有效部分不能特異性地匹配到參照基因組上。然而和其他所有新生技術(shù)一樣，RNASeq 技術(shù)也面臨著一系列新問題：其一是龐大的數(shù)據(jù)量所帶來的信息學(xué)難題。其三，目前的高通量測序技術(shù)大都需要較多的樣品起始量。雖然 RNASeq 技術(shù)還面臨著種種困難，但作為一個剛剛起步的新技術(shù)，相信隨著相關(guān)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展和測序成本的進(jìn)一步降低，RNASeq必將在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域占主導(dǎo)地位。Downey TJ, Spitznagel EL et al. Evaluation of gene expression measurements from mercial microarray platforms. ucleic Acids Res.Oct 1。 proteomics, 2002.
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