cr的原理與應(yīng)用ppt課件-閱讀頁(yè)
2025-05-27 13:49本頁(yè)面
【正文】 ncrease follows exponential ? Eventually plateaus Theoretical Real Life Log Target DNA 定量的最佳時(shí)期 Quantitative information es from monitoring the early stages of amplification. Real Life Detector Theoretical Log Target DNA Cycle 普通 PCR和 熒光定量 PCR的區(qū)別 ? 常規(guī) PCR是通過(guò)電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的最終產(chǎn)物進(jìn)行定性分析（ 定量不準(zhǔn)確 ），無(wú)法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)； ? 熒光定量 PCR是在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見(jiàn)”，通過(guò) Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA (or cDNA) 的起始濃度進(jìn)行定量的方法（ 準(zhǔn)確定量 ） 。由于反應(yīng)體系中的熒光染料或熒光標(biāo)記物 (熒光探針 )與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比。 ?熒光化合物分為兩類(lèi) （ 1）非特異性的嵌入熒光染料 ：利用嵌入熒光染料檢測(cè)，只是簡(jiǎn)單地反映 PCR反應(yīng)體系中總的核酸量，是一種非特異性的檢測(cè)方法。 非特異性的嵌入熒光染料 （ Nonspecific DNA binding dyes） – SYBR174。 Gold – Ethidium Bromide RealTime PCR， SYBR green Cycle 1 Cycle 3 Cycle 2 Molecular Probe公司的一個(gè)專(zhuān)利產(chǎn)品， US Patent 5,436,134 1993年 7月12日申請(qǐng) SYBR green 的優(yōu)缺點(diǎn) ? 簡(jiǎn)便 – 可以使用已有的引物 ? 普遍通用 – 可以檢測(cè)所有的雙鏈 DNA，包括引物二聚體； – 需要化大力氣優(yōu)化反應(yīng)條件，以消除非特異性擴(kuò)增； ? 價(jià)格 – $1 / PCR 反應(yīng) ? 定量的靈敏度有所欠缺 Extension 5’ 3’ 5’ 3’ Extension Continued Apply Excitation Wavelength 5’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq 3’ 5’ 3’ Taq Taq Repeat DNA binding dyes BD BD BD BD BD BD BD BD BD BD l l l l l 特異性的熒光探針 ? 特異性的熒光探針是把熒光化合物標(biāo)記到特異性的寡核苷酸上形成熒光標(biāo)記的 DNA探針。 ? TaqMan探針 定量 PCR， TaqMan體系 ? ABI 公司首先推出 (PRISM 7000系列 ) US Patent 5,723,591, 1995年 11月申請(qǐng)。 ? 當(dāng)探針單獨(dú)存在時(shí) ,由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生 ,R的熒光受到 Q的猝滅。 ? 一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號(hào)的產(chǎn)生。因此 ,Taqman探針檢測(cè)的是積累熒光。在 熒光背景信號(hào)階段 ，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。 PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。 為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為 CT 值 。 principle of quantitative realtime PCR… use when rather than how much fluorescent signal? PCR cycles? Low (high copy no.) High CT (low copy no.) realtime PCR amplification plots (7 x 10fold dilns. + NTC) End point (not quantitative) threshold of detection CT Threshold Cycle, CT ? Correlates strongly with the starting copy number ? Is linear with the log of starting copy number The least? Which one has the most? TaqMan系統(tǒng)的一個(gè)例子 10ng Titrate a templa
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