原核表達實驗ppt課件-閱讀頁
2025-05-21 18:02本頁面
【正文】 ? 再依次將另外 9張濾紙 (1張濾片 )在 Towbin buffer中浸潤后放置在蛋白膠上。 ? 轉(zhuǎn)移完成后，取出 NC膜，在 TBS漂洗 5min，置入麗春紅染液中染色，出現(xiàn)蛋白條帶后，用自來水漂洗 1min，用鉛筆標記處蛋白質(zhì) Marker的位置，然后加入 TBS漂洗至顏色消失； 9層濾紙－電轉(zhuǎn)緩沖液 9層濾紙－電轉(zhuǎn)緩沖液 陽極 (+) 陰極 () TransBlot SD with Gel Sandwich 操作步驟 3 膜的封閉 ? 用含有 5％脫脂牛奶的 TBST封閉 NC膜（含有%吐溫 20的 1倍的 TBS），在室溫條件下孵育 1至 2小時 (推薦在 4℃ 條件下孵育過夜 )； ? 用 TBST漂洗： 15分鐘， 1次； 5分鐘， 2次。 操作步驟 4 一抗雜交 操作步驟 5 二抗進行雜交 ? 在室溫條件下，將 NC膜轉(zhuǎn)入含有 1％脫脂牛奶和合適稀釋度的二抗的 TBST溶液中 (1:5000)，孵育 1小時； ? 用 TBST漂洗： 15分鐘， 1次； 5分鐘， 3次。 ?再向其中加入 B液 （ DAB溶液）和 C液（濃縮過氧化氫溶液）各一滴，再次混勻， （此液需現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后避光保存， 30min內(nèi)使用。 Towbin Buffer： 25mM Tris 192mM glycine 20% methanol 10 TBS緩沖溶液（ 1L） TrisBase ， NaCl 80g ， 緩沖液配方： 第一組，第二組，第三組 配 YPD液體培養(yǎng)基 葡萄糖 20g，酵母提取物 10 g，蛋白胨 (Peptone)20g， 1L。 （ ： 1mol/L K2HPO4 ， 1mol/L KH2PO4 ，定容至 1L，調(diào)節(jié) pH，定容至 1L） 分裝 50ml/250ml 三角瓶， 60瓶 第八組， 第九組，第十組 配 LB液體培養(yǎng)基 L 胰蛋白胨 10g(TRPTONE)，酵母提取物 5g， NaCl 10g， 1L 分裝 50ml/250ml 三角瓶， 30瓶 200ml/500ml 三角瓶， 10瓶 第十一組， 第十二組，第十三組，第十四組 PA瓶 150個， 50ml離心管 100個，各式槍頭 30盒，洗好包好，滅菌 250ml三角瓶 200個洗好 500ml三角瓶 50個，試劑瓶 20個洗好 第十五組 配置 10% SDS（ w/v） 500 ml Tris甘氨酸電泳緩沖液 : 配成 5 貯存液備用，在 900ml去離子水中溶解 94g甘氨酸， 然后加入 50ml 10%（ w/v）的電泳級 SDS貯存液， 用去離子水補至 1000ml。 ? YPD培養(yǎng)基 蛋白胨（ Peptone） 20g，酵母浸出物 10g，葡萄糖 20g，調(diào)節(jié) pH至 ，用蒸餾水定容至 1L。
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