【正文】 ?色譜峰位于被測組分色譜峰附近，或幾個被測組分色譜峰中間，并完全分離。求出斜率、截距后。 ?計算試樣的含量。 與經(jīng)典液相色譜法相比 ? 顆粒極細（一般為 10?m以下）、規(guī)則均勻的固定相， (鍵合相 )傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高； ? 高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快； ? 高靈敏度檢測器，靈敏度大大提高。 與氣相色譜法相比 ? 不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應用范圍廣； ? 可選用各種溶劑作為流動相，對分離的選擇性有很大作用，選擇性高； ? 一般在室溫條件下進行分離，不需要高柱溫。（經(jīng)典：水飽和的硅膠） ? 流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑 ?如烷烴加醇類。 ?流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組分 k減小， tR 減小。非極性至中等極性的組分，（還有有機酸、堿及鹽等） 保留機制 疏溶劑理論（ solvophobic theory） 溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的 排斥力 ，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生 疏水締合 。 同系物碳數(shù)越多，極性越弱， k越大； 引入極性取代基，降低疏水性， k值變小。 硅膠表面 鍵合烷基的濃度越大 ，則溶質(zhì)的 k越大。 ? 離子抑制色譜法 （ ion suppression chromatography； ISC ） ? 用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動相的 pH，抑制有機弱酸、弱堿的離解，增加疏水締合作用，使 k變大。 （三）反相離子對色譜法 paired ion chromatography； PIC ion pair chromatography； IPC 反相離子對色譜法 ? 離子對模型 3 3 + + ( ) + 3 s 3 ( + 固定相 + ( ) + B ) + B + H+ BH RSO Na RSO + Na+ BH RSO RSO ) BH 離子對 m B + A B A m A ( s ? ? ? ? mBAmmmsmsB AA][A][B]AB[]B[]A[B ??????????????? EK流動相 通式 影響容量因子的因素 ?離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的 k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的 k增大 ?流動相的 pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的 k值最大 ?固定相 、流動相性質(zhì)（同一般 RPHPLC）。 ?分析酸類或帶負電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（ TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（ CTAB）等 ?分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（ PICB5）、正己烷基磺酸鈉（ PICB6）、 適用范圍和離子對試劑的選擇 第二節(jié) 高效液相色譜法的固定相和流動相及其選擇 ? 固定相應符合下列要求： ?顆粒細且均勻； ?傳質(zhì)快； ?機械強度高，能耐高壓； ?化學穩(wěn)定性好，不與流動相發(fā)生化學反應。 鍵合相的種類 ? 弱極性鍵合相： ? 醚基和二羥基等鍵合相 ?用于反相或正相色譜 ? 極性鍵合相： ?常用氨基 ﹑ 氰基鍵合相（氰乙硅烷基≡ Si(CH2)2CN)鍵合硅膠 ?一般用于正相色譜 ? 特殊用途的鍵合相 （二）鍵合相的性質(zhì)和特點 ? 鍵合反應 ?硅氧烷（ Si－ O－ Si－ C）型：氯硅烷與硅膠進行 硅烷化反應 2 2Si OH Cl CH+ Si Si SiClH18 OR118 HC 3737RRR 1如： YWG－ C18H37，無定形硅膠 YWG上鍵合了 十八硅烷基； Spherisorb ODS，球形硅膠 Spherisorb 上鍵合了 ODS。 ? 鍵合相的特點 ?使用過程中不流失； ?化學穩(wěn)定性好； ?適于梯度洗脫； ?載樣量大 ? 注意： ?流動相的 pH一般應在 38，否則會引起硅膠溶解； (也有適用寬 pH范圍的鍵合相 )。 ?對試樣有適宜的溶解度。例如用紫外檢測器時，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。低粘度流動相如甲醇 ﹑乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。 22114nkkααR????? （二）流動相的強度和選擇性 ? 溶劑的極性（強度） ?正相色譜：溶劑極性越強，洗脫能力越強 ?反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強 ? 溶劑的選擇性 ?不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同 ? 混合溶劑（二元或多元流動相） 三、分離條件的選擇 ? （一） HPLC中的速率理論 ?渦流擴散 A=2λ dp ?球形、小粒度、均勻（ RSD＜ 5%）固定相，勻漿高壓填充，以降低 A。 ?因為 Dl很小，室溫操作，且 U大于U最佳 ， HPLC中的速率理論 ?傳質(zhì)阻抗 ?固定相傳質(zhì)阻抗 CS可以忽略 ，因 df極小 ?流動相傳質(zhì)阻抗 Cm ?要求： dp小， Dm大 m2Pmm DdC ???靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗 ： ?由于部分流動相在固定相微孔內(nèi)的滯留 ?靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗系數(shù) Csm ?Csm ∝ dp2， Csm ∝ 1/Dm，而Dm∝T /η ?要求 : 固定相 dp 流動相 η 都小 HPLC中的速率理論 H=A+Cmu+Csmu ?原因：化學鍵合相，液體流動相 ?結果： HPLC的實驗條件應該是：①小粒度、均勻的球形化學鍵合相；②低粘度流動相，流速不宜過快；③柱溫適當。常用柱塞往復泵 ?雙泵：為了克服流量的脈動。 三、檢測系統(tǒng) ? （一）檢測器 (detector)的主要性能 ?要求： ?靈敏度（ sensitivity）高（檢測限低） ?噪音（ noise）低 ?線性范圍（ linear range）寬 ?重復性（ repeatability）好 ?適用范圍廣（通用型、專屬型） （二）紫外檢測器 (ultraviolet detector) ? 檢測原理： ?朗伯－比爾 (LambertBeer) 定律，響應信號（吸光度）與濃度成正比 A=εCl ? 特點： ?靈敏度較高（ 106— 109 g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應用廣（分析、制備）。 ? 專屬型、濃度型檢測器 紫外檢測器 ? 固定波長檢測器 ： 254nm ? 可變波長檢測器： ?光源：氘燈（和鎢燈）， 200— 400（ 800）nm，單色器，流通池（試樣），光電 管 ?光路系統(tǒng)和紫外分光光度計相似 ? 光電二極管陣列檢測器 (photodiode array detector； PDAD)： ?一系列光電二極管， 一個二極管對應接受光譜上約 1nm譜帶寬的單色光 紫外檢測器 ? 光電二極管陣列檢測器 ? 工作原理：復光通過流通池，再進入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時獲得各波長的信號強度，即獲得組分的吸收光譜。 ? 用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量 ,判斷峰純度。 F=KC 熒光檢測器 (fluorescence detector；FD) ? 特點： ?選擇性好，專屬型檢測器 ?靈敏度比紫外檢測器高（檢測限 1010 g/ml） ? 激發(fā)波長 (?ex)和發(fā)射波長 (?em)的選擇 第四節(jié) 高效液相色譜分析方法 ? 定性分析方法 ? 定量分析方法： 外標法、內(nèi)標法 同 GC（自己看） 主要內(nèi)容 ? 化學鍵合相色譜法的原理： ?反相鍵合相色譜法 ?反相離子對色譜法 ?正相鍵合相色譜法 ? 化學鍵合相色譜法的固定相、流動相 ? 化學鍵合相色譜法的分離條件 ? 高效液相色譜中的速率理論 ? 定量分析方法 ? 紫外、熒光檢測器