【正文】 y mice. The procedure yields a cell line capable of producing one type of antibody protein for a long period. A tumor from this immortal cell line is called a hybridoma. ? No method of generating a hybridoma that avoids the use of animals has been found. Recent in vitro techniques allow the intracellular production of antigenbinding antibody fragments, but such techniques are still experimental and have an uncertain yield, efficacy, and antibody function (Frenken and others 1998). It has also been possible to geically replace much of the mouse mAb producing genes with human sequences, reducing the immunogenicity of mAb destined for clinical use in humans. Before the advent of the hybridoma method, investigators could produce only polyclonal serum antibodies。 C. Some cell clumping will be evident. The suspension is spun at 1000 rpm for 34 min. (at this point you should see the different layers of cells with PEG on top). Slowly add 37176。 C IMDMm. Bring to 20 ml and add to the flask in the incubator. (If using feeder cells, add them at this point。 C. BLOCKING Wash unbound Ag by inverting the plates and flicking the wells dry. Rinse by adding PBS to each well and inverting it again (use squirt bottle). Repeat the rinse twice. Add 100 ul of blocking solution to every well, leave 1 hr at room Temp or at 4176。 C. SECONDARY ANTIBODY Wash unbound antibody 4 times with PBS + % Tween 20. Add 100 ul of enzyme linked antibody to all wells. Do the appropriate dilutions in the Elisa buffer. (ex: HRP is 2022X). Leave 1 hr at room temp or at 4176。 C. Some cell clumping will be evident. The suspension is spun at 1000 rpm for 34 min. (at this point you should see the different layers of cells with PEG on top). Slowly add 37176。 C IMDMm. Bring to 20 ml and add to the flask in the incubator. (If using feeder cells, add them at this point。 組織的消化 通過生物化學(xué)的方法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團或單細(xì)胞。如最常用的有胰蛋白酶和膠原酶等。其他的酶如鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動物細(xì)胞的消化。 （ 1）向培養(yǎng)瓶中放入 1－ 5mm3大小的組織塊，加 5ml2022單位 /ml的膠原酶干液，最終濃度為 200單位 /ml， pH=。 （ 3 ）當(dāng)組織變軟，分散于瓶底時，輕輕震蕩即散成細(xì)胞團或單個細(xì)胞，小心倒出培養(yǎng)液。 （ 5 ）加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液。 HAT選擇系統(tǒng)－－基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選 ? HAT是含一定濃度 次黃嘌呤（ Hypoxanthine,H） 、 氨基喋呤（ Aminopterin， A ） 及 胸腺嘧啶核苷（ Thymidine， T） 的一種 選擇性培養(yǎng)基 ，其中三種成分與細(xì)胞 DNA合成有關(guān)。 基于 HAT培養(yǎng)基的篩選系統(tǒng) H（ Hypoxanthine次黃嘌呤）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷酸前體 A（ Aminopterin，氨基喋呤）阻斷核苷酸的從頭合成 T（ Thymidine，胸腺嘧啶）應(yīng)急途徑中所提供之外源核苷酸前體 HGPRT酶缺陷型細(xì)胞株（長期培養(yǎng)系） 不能在 HAT培養(yǎng)液中生長 正常細(xì)胞 體外生存能力有限，最終也將死亡 融合細(xì)胞 最后，只有融合細(xì)胞在 HAT培養(yǎng)液中存活 特異性雜交瘤細(xì)胞的篩選 ? 通過選擇性培養(yǎng)后生長的雜交瘤細(xì)胞，僅有部分是分泌預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。 ? 可溶性抗原 可采用放射免疫、免疫酶標(biāo)測定、間接血凝等方法測定。 利用培養(yǎng)基對單抗進(jìn)行鑒定的過程 ?ABSORBTION OF ANTIGEN ?BLOCKING ?PRIMARY ANTIBODY ?SECONDARY ANTIBODY ?SUBSTRATE 雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng) 利用單個細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細(xì)胞系。 方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應(yīng)用熒光激活分選儀等。 方法是將降植烷或石蠟油注入 Balb/c小鼠腹腔， ，7天后腹腔接種 3~5 10^6 雜交瘤細(xì)胞。 2）利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。 ? 用 同位素標(biāo)記的單抗 在特定的組織中成象的技術(shù)可以用于腫瘤、心血管畸形的 體內(nèi)診斷 。 ? 利用氧化劑把藥物分子上的糖基氧化成羰基。 ? 這樣的靶向制劑保留一定的藥物活性，并具有一定的選擇性。 ?2）藥物 通過小分子 與單抗連接 ? 通過一些小 分子交聯(lián)劑 ，把藥物分子上的某些基團連接起來。 ? 順烏頭酸酐制成的最常用，在中性條件下較穩(wěn)定，在酸性條件下容易發(fā)生水解。 ?3）藥物通過 大分子 與抗體相連 ?大分子聚合物：葡聚糖、多聚賴氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。 雜交人－鼠單克隆抗體 chimeric 鼠源抗體一般無法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi)系統(tǒng)，還可能引發(fā)人對鼠源抗體本身的免疫反應(yīng)。對鼠源抗體進(jìn)行改造，利用人源的 Fc區(qū)域的DNA片段替換鼠源單抗的 Fc的 DNA片段。 人源單克隆抗體 低免疫原性、高效性 方法 1：分離人 B細(xì)胞，使之與熒光標(biāo)記的抗原相結(jié)合，通過熒光標(biāo)記選擇能產(chǎn)生特殊抗體的 B細(xì)胞，并用 Epstein－ Barr病毒轉(zhuǎn)化，得到少量的單抗。 方法 3：將改造過的人的抗體基因?qū)胧笈咛ブ?，能在免疫后得到產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因鼠。可以保留不同程度的抗體結(jié)合特異性和激發(fā)其他免疫反應(yīng)的能力。 ? 制備抗體酶的方法： ? 1）利用與過渡態(tài)結(jié)構(gòu)相類似的半抗原通過雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)抗體酶。 ? 3）對抗體進(jìn)行化學(xué)修飾，使抗體與催化基團相連。 ? 單鏈 FV片段 :抗體體積小、免疫原性較低，滲透性好，用于實體腫瘤的診斷和治療。 ? 雙功能抗體片段： 兩個抗原結(jié)合特異性不同的 Fab或 Fv片段通過二硫鍵連接起來，如一個結(jié)合腫瘤特異性抗原，一個結(jié)合殺傷性 T細(xì)胞，這樣識別和消滅腫瘤細(xì)胞的功能可以統(tǒng)一在一個單鏈抗體分子上。 ? 利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時也增加了疫苗的安全性。 ? 單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展。 ? 2 為什麼要對鼠源性 McAb進(jìn)行改造使之人源化？ ? 3 制備單抗靶向制劑的主要方法有哪些？單抗靶向制劑有何實際意義？ ? 4 簡述利用細(xì)胞工程制備人源性 McAb的方法有哪些？它們的優(yōu)勢與難點如何？ 本章結(jié)束 謝謝！