基因的體外重組和轉(zhuǎn)化-閱讀頁
2025-05-14 05:53本頁面
【正文】 l2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，再加入 DNA， Ca2+與 DNA結(jié)合形成抗 DNase的羥基 磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上；經(jīng)短暫的42℃ 熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加， DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 JM109感受態(tài) 含氨芐平板 Am 重組質(zhì)粒 感受態(tài) 轉(zhuǎn)化項(xiàng)目 CaCl2 受體菌 DNA 液體 LB 皿 a陽性對照 —— 10ul PBR322DNA 100ul 1 b陰性對照 ① 10ul —— 2ul連接液 100ul 2 c陰性對照 ② —— 10ul —— 100ul 3 d 連接液轉(zhuǎn)化組 —— 60ul 6ul連接液 600ul 4 ?具體操作： 冰浴 30’； 42℃ 2’ ；冰浴 2’ ；加 37℃ 預(yù)熱 LB培養(yǎng)45’；表中 a、 b、 c各取 100ul/皿涂布 ， 連接液轉(zhuǎn)化組 d梯度涂布 I 50ul?2皿； ?2皿 ）37℃ 倒置培養(yǎng)過夜 ；檢查細(xì)菌生長情況 。這個cDNA的兩側(cè)具有 BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從 BamH[的位點(diǎn)插入載體中。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。 實(shí)驗(yàn)中同時設(shè)置了 4個對照： ? 對照 1： 將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上； ? 對照 2： 將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上； ? 對照 3： 將經(jīng)切割 (但未用堿性磷酸酶處理 )并用連接酶連接 (但沒有 cDNA片段 )的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)乎板上； ? 對照 4： 將經(jīng)切割 (并用堿性磷酸酶處理過 )并用 DNA連接酶連接 (但沒有 cDNA片段 )的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)子板上。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出 12個菌落，分離了質(zhì)粒 DNA，并用 BamHI進(jìn)行切割，其中 9個克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個 cDNA片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。 ? (1)你如何看待第一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ?對照 1的目的是什么 ? ? (2)影響第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是什么 ?對照2的作用何在 ? ? (3)對照 3和 4各有什么作用 ? ? (4)為什么要用堿性磷酸酶處理載體 ?
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