【正文】 穩(wěn)定性； ③外源蛋白的累積部位； ④產(chǎn)量的提高。 在利用甲醇路徑中，第一個用在 P. pastoris中的酶為乙醇氧化酶 (AOX)，在 H. ploymorpha中為甲醇氧化酶 (MOX)，而且 AOX/MOX表達為高度調(diào)控的，完全誘導都需要甲醇的存在。表達 AOX/MOX的強大可調(diào)控啟動子已用于生產(chǎn)重組蛋白。 P. pastoris 表達載體包括 AOX啟動子、 AOX序列、 AOX終止序列，其中的多個克隆位點供外源基因插入，以組氨酸脫氫酶基因 (HIS4)為互補性篩選標志，還包括部分 pBR322質(zhì)粒序列，使之成為在大腸桿菌中繁殖的穿梭質(zhì)粒。甲醇酵母能大量分泌異源蛋白，對質(zhì)粒也能發(fā)生高頻整合，用一系列方法可增加拷貝數(shù)，提高產(chǎn)量。 點突變可通過大量的基因拷貝數(shù)解決，原因是突變會被大量的正常基因覆蓋掉。 3）轉(zhuǎn)譯錯誤可通過對 DNA修改來防止，如選用酵母合適的密碼子以避免錯誤地插入tRNA和由于使用酵母中稀有密碼子而引起的轉(zhuǎn)譯中斷和移位，以提高正確的產(chǎn)物產(chǎn)量。 5）生產(chǎn)分泌蛋白時，能夠糖基化和形成二硫鍵，而且能在信號肽的引導下進行分泌，但用KEX2蛋白酶除去 α 因子的前導肽序列常不夠完全，導致分泌蛋白有一個過長的氨基酸末端。 6）糖基化 酵母能進行 N糖基化，但主要是甘露糖型；還會發(fā)生過糖基化，而這樣的糖基化會導致潛在免疫性。 7）蛋白折疊和分泌 在酵母中蛋白表達很高，如人血清白蛋白在 P. pastoris中可達 4g/L，但有一些蛋白分泌后折疊錯誤，滯留在 ER腔內(nèi)。 第五節(jié) 昆蟲細胞表達體系 昆蟲表達系統(tǒng)是一類應用廣泛的真核表達系統(tǒng)，它具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。 利用 重組桿狀病毒 在昆蟲細胞系中表達外源蛋白是目前較為流行的表達系統(tǒng)，以核型多角病毒 (NPV)的蛋白基因的強啟動子建立的表達載體系統(tǒng)是極有潛力的新型表達載體系統(tǒng)。表達產(chǎn)物能向細胞外分泌，生物活性高。 另一類昆蟲細胞表達系統(tǒng)則是建立在對果蠅等昆蟲細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)之上的，在穩(wěn)定性和表達效率方面更為突出。 一．以重組桿狀病毒為載體的昆蟲表達體系 重組桿狀病毒表達系統(tǒng)是在真核環(huán)境中高效表達外源蛋白的有力工具。 ①具有完整的感染性，可容納 100kb的外源 DNA，能克隆多個外源基因； ②不依賴輔助病毒，懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞可增殖到很高的滴度； ③多數(shù)表達的蛋白在昆蟲體內(nèi)能保持可溶狀態(tài)，有利于大量分離表達蛋白； ④在自然界生存短暫，可以保證生物安全； ⑤病毒的專一性，不能感染脊椎動物細胞，其啟動子在哺引動物中是失活的，有利于表達腫瘤相關(guān)基因及有潛在毒性蛋白。 PDV可保護膠囊化的病毒避免熱和干燥等外部因素的破壞，而當受感染的昆蟲死后，大量的PDV可以作為寄主分解物釋放出來。 盡管多角體蛋白是昆蟲體內(nèi)含量最高的蛋白(約占總細胞總蛋白的 30％～ 50％ )，但它并非必需蛋白，可以用外源 ORF替代多角體蛋白 ORF來構(gòu)建表達載體。 二．桿狀病毒表達系統(tǒng)的效率與加工能力 桿狀病毒載體可依據(jù)所表達的是包含體還是可溶蛋白來分類，也可依據(jù)同時表達的蛋白數(shù)量來分類。 多數(shù)載體利用的都是晚期啟動子 P10或polyhedrin，在桿狀病毒復制的晚期，絕大多數(shù)蛋白的合成都已終止了，僅有 P10和polyhedrin啟動子仍保持活躍狀態(tài)，這樣就可以自然富集目的蛋白。 昆蟲表達系統(tǒng)擁有原核表達系統(tǒng)所不具備的加工能力，但使用晚期啟動子時，在病毒復制的末期對產(chǎn)物的修飾可能已經(jīng)發(fā)生了變化，所以對產(chǎn)物蛋白的修飾也并非是完全和有效的。 盡管在昆蟲細胞內(nèi)可以完成蛋白的糖基化，但作用方式和哺乳動物卻有所不同。 昆蟲表達系統(tǒng)對蛋白前體的蛋白酶切割能力方面，雖然多數(shù)哺乳動物的分泌信號肽可以在昆蟲細胞中得到精確處理，但帶有信號肽序列卻未必能分泌成熟蛋白。 桿狀病毒表達系統(tǒng)每升細胞培養(yǎng)物能夠提供 500mg甚至 700mg重組目的蛋白。 外源蛋白的表達還要受諸多因素的影響，高質(zhì)量的培養(yǎng)基是獲得高效表達的前提，昆蟲細胞培養(yǎng)要求相對較高的氧濃度以及有高活性且生長在對數(shù)期的細胞。 三．其它昆蟲表達系統(tǒng) 另一類穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的表達系統(tǒng)是建立在用適當啟動子驅(qū)動外源基因?qū)ハx進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上。 此外，利用轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化昆蟲也是一種重要的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法。 利用鱗翅目昆蟲轉(zhuǎn)座子 piggyBac構(gòu)建的衍生載體成功地對家蠶進行了種系轉(zhuǎn)化，這為鱗翅目昆蟲的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化開辟了道路。 比如在表達抗內(nèi)皮細胞選擇蛋白單鏈抗體時發(fā)現(xiàn)該蛋白在果蠅細胞 SC2的培養(yǎng)上清中有～ ，但在復性的大腸桿菌培養(yǎng)上清和周質(zhì)腔的可溶蛋白中都檢測不到目的蛋白。 隨著桿狀病毒載體的不斷優(yōu)化，特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細胞表達系統(tǒng)的逐步成熟，昆蟲表達系統(tǒng)將會日益成為最有希望的真核表達系統(tǒng)。 哺乳動物細胞表達體系的優(yōu)越性是，它表達的高等真核蛋白總是正確地被修飾（二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進行的裂解等）。 哺乳動物細胞所表達的蛋白質(zhì)幾乎總是在恰當?shù)募毎麅?nèi)一定區(qū)域累積。培養(yǎng)和篩選一個高度擴增的轉(zhuǎn)化子 CHO細胞，通常需要數(shù)月時間，難度較大。 CHO細胞表達體系適合大規(guī)模表達蛋白質(zhì)。 長期培養(yǎng)哺乳動物細胞需要專門的多參數(shù)控制系統(tǒng)，如控制 pH、 CO溫度、壓力、攪拌速率等。 但是其轉(zhuǎn)移基因在靶細胞核中表達效率不高，原因可能是靶細胞漿內(nèi)溶酶體對脂質(zhì)DNA復合物降解所致，使得能穿過核膜入核的 DNA少。 T7啟動子來自噬菌體 T7， IRES來自于心肌炎病毒的 5’非翻譯區(qū)。 CAT基因的表達與轉(zhuǎn)染復合物中加入的 T7RNA聚合酶的量成正比，而且如果有足夠量 T7RNA聚合酶，胞漿表達系統(tǒng)的表達效率可高于細胞核內(nèi)的表達效率。 再生基因由 T7啟動子與 T7RNA聚合酶編碼序列組成。