【正文】 蛋白質(zhì)工程的目的改變蛋白質(zhì)的生物活性；改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；改變蛋白質(zhì)的特性；用于蛋白質(zhì)與功能研究 13 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)包括哪幾級結(jié)構(gòu)？試述各種結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系？ （ 1） 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括：一級結(jié)構(gòu) 、 二級結(jié)構(gòu) 、 三級結(jié)構(gòu) 和 四級結(jié)構(gòu) 。 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)主鏈原子的局部空間結(jié)構(gòu) ,并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈構(gòu)象 ,二級結(jié)構(gòu)的種類有α 螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。 三級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈主鏈和側(cè)鏈原子的空間排布。 四級結(jié)構(gòu)是指兩條以上具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈之間締合在一起的結(jié)構(gòu)。維持其穩(wěn)定的是次級鍵 ,如氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力等。一級結(jié)構(gòu)相似其功能也相似 ,例如不同 哺乳動物的胰島素一級結(jié)構(gòu)相似 ,僅有個(gè)別氨基酸差異 ,故他們都具有胰島素的生物學(xué)功能；一級結(jié)構(gòu)不同 ,其功能也不同；一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 ,則蛋白質(zhì)功能也發(fā)生改變 ,例如血紅蛋白由 2 條α鏈和 2 條β鏈組成 ,正常人β鏈的第 6 位谷氨酸換成了纈氨酸 ,就導(dǎo)致分子病 鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的發(fā)生 ,患者紅細(xì)胞帶氧能力下降 ,易溶血。如核糖核酸酶變性或復(fù)性時(shí) ,隨之空間結(jié)構(gòu)破壞或恢復(fù) ,生理功能也喪失或恢復(fù)。 血紅蛋白的結(jié)構(gòu)； ； 14 結(jié)構(gòu)域、模體、協(xié)同效應(yīng)、變構(gòu)效應(yīng)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)聯(lián)配（比對）、同源體與相似體、蛋白質(zhì)組學(xué) 結(jié)構(gòu)域 ： 大分子蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)?？煞指畛梢粋€(gè)或數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行其功能 模體：蛋白質(zhì)分子中，二個(gè)或三個(gè)具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個(gè)具有特殊功能的空間構(gòu)象，被稱為模體 (motif)。 變構(gòu)效 應(yīng)：凡蛋白質(zhì)（或亞基）因與某小分子物質(zhì)相互作用而發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)（或亞基）功能的變化，稱為蛋白質(zhì)的變構(gòu)效應(yīng) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)聯(lián)配（比對） ：將兩個(gè)相似的三維結(jié)構(gòu)盡可能重疊在一起，這樣使得結(jié)構(gòu)上對應(yīng)殘基的主鏈原子在空間盡可能的靠近。通過結(jié)構(gòu)聯(lián)配找到同源關(guān)系更遠(yuǎn)的蛋白質(zhì)，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)要比序列更加保守。 Rasmol：是最著名的大分子結(jié)構(gòu)可視化工具之一。通過用 Interpro 之類個(gè)工具分析序列可以查詢這個(gè)蛋白質(zhì)中可能存在的已知結(jié)構(gòu)域，揭示出蛋白質(zhì)中所有的結(jié)構(gòu)域組成。 第二步：如果查出序列與已知結(jié)構(gòu)的序列有較高的相似度，則可以采用比較建模法，由 SWISSMODEL 提供的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)可以完成這個(gè)任務(wù)，如果 SWISSMODEL 上的搜索是成功的，則可以直接通過它進(jìn)一步建立完整的結(jié)構(gòu)模型。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測可以可以用于任何蛋白質(zhì)序列，（球蛋白的結(jié)構(gòu)域的預(yù)測要比膜蛋白更加準(zhǔn)確）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測完成后則是進(jìn)行折疊識別，該方法能確定二級結(jié)構(gòu)是如何包裹成三級折疊的，這些方法的預(yù)測精度通常也要比標(biāo)準(zhǔn)比較建模法低得多。 20 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的原理是包括哪些方面？ 1） 內(nèi)核假設(shè)。在大多數(shù)情況，內(nèi)核由氫鍵連接的二級結(jié)構(gòu)單元組成 2）所有蛋白質(zhì)內(nèi)部都是密堆積（很少有空穴大到到可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰性氣體），并且沒有重疊 3）所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的（主鏈及側(cè)鏈） 4）疏水與親水基團(tuán)需要合理地分配在 溶劑可及表面及不可及表面； 5）在金屬蛋白中，配位殘基的替代要滿足金屬配位幾何，符合正確的鍵長、鍵角及整體的幾何； 6）對于金屬蛋白，大部分配基含有多于一個(gè)與金屬作用或形成氫鍵的基團(tuán)。獨(dú)特的分子間相互作用是生物相互作用及反應(yīng)的標(biāo)志。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究范疇： 1）蛋白質(zhì)分離：蛋白質(zhì)分離方法、蛋白質(zhì)組表達(dá)譜 2）差異蛋白質(zhì)組：差異蛋白質(zhì)尋找及驗(yàn)證、蛋白質(zhì)表達(dá)定量技術(shù) 3）蛋白質(zhì)互作：蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)譜 4）蛋白質(zhì)修飾：蛋白質(zhì)修飾類型、修飾對蛋白質(zhì)功能的影響 5）生物信息學(xué)：肽質(zhì)量數(shù)據(jù)分析、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫建設(shè) 23 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的原理及其類型？ 原理 ： 將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板 、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光抗菌素體的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到測定各種蛋白質(zhì)功能的目的。 捕獲試劑：抗體、寡居核苷酸、肽適配體、抗體模擬試物、細(xì)胞骨架、 限制發(fā)展因素： 1 難以獲得和表達(dá)足夠數(shù)量的抗體用于大規(guī)模研究； 2 難以獲得足夠特 異性的抗體。這種抗原可以是蛋白質(zhì)，也可以是其它分子，如肽或者糖類。 24 蛋白質(zhì)相互作用研究的方法有哪些？ 1） 生物物理學(xué)方法： Pull Down 試驗(yàn)、親和印跡、免疫共沉淀、熒光共振轉(zhuǎn)移技術(shù) 2） 分子生物學(xué)方法：噬菌體展示技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù) 3） 遺傳學(xué)方法：基因外抑制子、合成致死篩選 25 酵母雙雜交技術(shù)的原理？ 將已知基因 (誘餌基因 )和靶基因或含有靶基因的 cDNA分別構(gòu)建在含 BD及 AD質(zhì)粒載體上 ,當(dāng)這兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞 ,若 BD結(jié)合的誘餌蛋白能夠與 AD結(jié)合的靶蛋白或文庫中某些 cDNA編碼的蛋白相互作用、彼此間結(jié)合時(shí) ,則會導(dǎo)致位于側(cè)翼的 BD 與 AD 在空間上接近 ,呈現(xiàn) GAL4 轉(zhuǎn)錄因子的完全活性 ,啟動下游的報(bào)告基因如 His 及 LacZ 等基因的表達(dá) ,從而在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長 26 熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)？ FRET 熒光能量轉(zhuǎn)移有三個(gè)基本條件：（ 1）給體與受體在合適的距離（ 1～ 10 nm）； （ 2）給體的發(fā)射光譜與 受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）； （ 3）給體與受體的偶極具有一定的空間取向（這是偶極 偶極耦合作用的條件）。序列比對是生物信息學(xué)的基礎(chǔ)，非常重要。 3） 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 包括二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，是最重要的課題之一。這是最重要的課題之一。泛指利用微生物制造或生產(chǎn)某些產(chǎn)品的過程 。 分批發(fā)酵 :培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。 補(bǔ)料分批培養(yǎng)：在分批 培養(yǎng)過程中補(bǔ)入新鮮的料液，以克服營養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過早結(jié)束的缺點(diǎn)。 半連續(xù)培養(yǎng) ：在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間歇放掉部分發(fā)酵液（帶放）稱為半連續(xù)培養(yǎng)。達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，整個(gè)過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。 液體培養(yǎng)基 :80%～ 90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。 比速：單位時(shí)間內(nèi)單位菌體消耗基質(zhì) 或形成產(chǎn)物（菌體）的量稱為比速，是生物反應(yīng)中用于描述反應(yīng)速度的常用概念 初級代謝產(chǎn)物：微生物合成的主要供給細(xì)胞生長的一類物質(zhì)。 次級代謝產(chǎn)物：對細(xì)胞的代謝功能沒有明顯的影響，一般是在穩(wěn)定期形成，如抗生素等產(chǎn)物 維持消耗 (m) ：指維持細(xì)胞最低活性所需消耗的能量，一般來講，單位重量的細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)用于維持消耗所需的基質(zhì)的量是一個(gè)常數(shù)。 直接參數(shù)又可分為：在線檢測參數(shù) （ 指不經(jīng)取樣直接從發(fā)酵罐上 安裝的儀表上得到的參數(shù)，如溫度、 pH、攪拌轉(zhuǎn)速； ）和 離線檢測參數(shù) （ 指取出樣后測定得到的參數(shù)，如殘?zhí)恰?NH2N、菌體濃度。 同步生長：培養(yǎng)物中所有的微生物細(xì)胞都處于同一生長階段，并能同時(shí)分裂的生長方式。 液晶狀態(tài)是指某些有機(jī)物在發(fā)生固相到液相轉(zhuǎn)變時(shí)的過渡狀態(tài)稱為液晶態(tài)。包括：1） 厭氧培養(yǎng)的生產(chǎn)過程，如酒精，乳酸等。 3 獲得發(fā)酵產(chǎn)品的條件有哪些？ 1） 適宜的微生物 。 4)精制成產(chǎn)品的方法的設(shè)備 4 工業(yè)發(fā) 酵步驟和工藝流程？ (1) 用作培養(yǎng)菌種及擴(kuò)大生產(chǎn)的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基的配制 (2) 培養(yǎng)基、發(fā)酵罐以及輔助設(shè)備的消毒滅菌 (3) 將已培養(yǎng)好的有活性的純菌株以一定量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中 (4) 將接種到發(fā)酵罐中的菌株控制在最適條件下生長并形成代謝產(chǎn)物 (5) 將產(chǎn)物抽提并進(jìn)行精制，以得到合格的產(chǎn)品 (6) 回收或處理發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢物和廢水 5 工業(yè)化菌種的要求有哪些？ 1）能夠利用廉價(jià)的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物 2）有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強(qiáng) 3）遺 傳性能要相對穩(wěn)定 。 5）產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)） 6）生產(chǎn)特性要符合工藝要求 6 在發(fā)酵工業(yè)上，常用的基因表達(dá)系統(tǒng)有哪些？并簡述其主要特點(diǎn)。表達(dá)蛋白的純化、分離及分析快速；外源基因的導(dǎo)入相對容易； 已建立了整套表達(dá)理論及技術(shù) . (二 ) 真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) : 酵母 (既是微生物又是真核細(xì)胞 ) 生長迅速，營養(yǎng)要求不高，易培養(yǎng)；安全性好 ；比哺乳動物細(xì)胞操作簡單；具有一定的修飾蛋白的能力。 7 目的微生物富集的方案有哪些？ 富集的三種方案： 1）定向培養(yǎng) :采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進(jìn)行培養(yǎng)。 (2)增加前體物的濃度。 (4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。 (6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。 方法： 1） 基因突變：自然選育、誘變育種； 2） 基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程； 3） 基因的直接進(jìn)化：點(diǎn)突變、易錯(cuò) PCR、同序法 DNA Shuffling 10 誘變育種中，用誘變劑處理時(shí)，應(yīng)該考慮的因素有哪些？ 化學(xué)誘變劑使用過程的安全性 ； 2）誘變劑量的選擇； 3）誘變劑的選擇； 4）出發(fā)菌株的選擇。 2） 在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。 4） 出發(fā)菌株開始時(shí)可以同時(shí)選 2～ 3 株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。 6） 根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥?一誘變劑的重復(fù)處理會使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。 12 微生物生長繁殖的測定方法有哪些？ （一）測生長量 直接法 ： 1） 測體積（離心） ； 2） 稱干重 離心法（單細(xì)胞微生物） 、 過濾法（絲狀微生物） 間接法 ： 1） 比濁法（分光光度計(jì)） 2） 生理指標(biāo)法 ： 含氮量 、 含碳量 、 DNA 含量測定 （二）計(jì)繁殖數(shù) 直接計(jì)數(shù)法 ： 血球計(jì)數(shù)法 、 涂片計(jì)數(shù)法 間接計(jì)數(shù)法 ： 涂布平板法 、 倒平板法 13 無分支單細(xì)胞微生物的群體生 長曲線包括幾部分，這幾部分各有什么特征、原因是什么？ 1）主要特征：代謝活躍，大量合成細(xì)胞分裂所需的酶類、 ATP 等；體積增大；分裂遲緩。 3）縮短和消除遲緩期的方法有：增加接種量、采用最適種齡、選用繁殖速度快的菌種以及盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)基介質(zhì)和條件一致。 （ 2）作用：作為代謝、生理等研究的好材料和發(fā)酵生產(chǎn)中用作種子的最佳菌齡。 （ 2）原因：營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗以及代謝廢物的積累抑制了生長。 特點(diǎn)：活的細(xì)胞數(shù)目以對數(shù)速率急劇下降、細(xì)胞裂解或自溶。 ，濕熱比干熱的滅菌效果好 （ 1）熱蒸汽對細(xì)胞成分的破壞作用更強(qiáng)。 ℃快速處理至少 15s 或 ℃處理 30min。 x 射線和γ射線，形成離子和自由基分子。 ，基本對人體無害。 ： （ 1）抑制細(xì)胞壁的合成（青霉素－－ G＋）（ 2）破壞細(xì)胞膜的功能（多粘菌素－－ G－） （ 3）抑制蛋白質(zhì)的合成（氯霉素－ 30s，鏈霉素－ 50s） （ 4）抑制核酸的合成（利福 霉素－－細(xì)菌 RNA 聚合霉， 新生霉素－－細(xì)菌 DNA） 18 論述培養(yǎng)基有哪些類型和功能？ 培養(yǎng)基按其組成物質(zhì)的純度、狀態(tài)、用途可分為三大類型 ： 1） 按純度 合成培養(yǎng)基 : 原料其化學(xué)成分明確、穩(wěn)定。 液體培養(yǎng)基 :80%～ 90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基主要作用是供給細(xì)胞生長繁 殖所需的各類營養(yǎng)物質(zhì)。有機(jī)氮有利于菌體的生長繁殖，能獲得更多的細(xì)胞。 3）斜面培養(yǎng)基中宜加少量無機(jī)鹽類，供給必要的生長因子和微量元素。 2） 種子培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高。 3） 種子培養(yǎng)基成分還 應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。 1） 碳源 來源：糖類、油脂、有機(jī)酸、正烷烴，工業(yè)上常用的糖類（葡萄糖、糖蜜、淀粉糊精） 作用：提供微生物菌種生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分；提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分 2）氮源 作用：氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸，蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物。 有機(jī)氮源成分復(fù)雜可以從多個(gè)方面對發(fā)酵過程進(jìn) 行影響，而另一方面有機(jī)氮源的來源具有不穩(wěn)定性。 3）無機(jī)鹽的微量元素 作用：各種不一樣 來源： C、 N 源，以鹽的形式補(bǔ)充 4）生長因子、前體和產(chǎn)物促進(jìn)劑 a 生長因子 從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的 有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。有機(jī)氮源是這些生長因子的重要來源，多數(shù)有機(jī)氮源含有較多的 B 族維生素和微量元素及一些微生物生長不可缺少的生長因子 指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。 5）水 對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因?yàn)樵诓煌粗写嬖诘母鞣N因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。 22 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)步驟包括哪些方面？設(shè)計(jì)中應(yīng)該注意哪些相關(guān)問題？ 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)步驟包括 1） 提供必要的營養(yǎng)成分：培養(yǎng)基成分必須滿足細(xì)胞生長，代謝活動和合成產(chǎn)物所需的基本要