動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物學(xué)知識-閱讀頁
2025-02-02 04:20本頁面
【正文】 。 ? 動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)對營養(yǎng)的要求較高，往往需要多種營養(yǎng)成分的優(yōu)化組合： ? 氨基酸 所有動物細(xì)胞都需要 12種基本氨基酸 （精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸）和 谷氨酰胺 。葡萄糖利用率最高。 ? 微量元素 細(xì)胞體外培養(yǎng)除需鉀、鈉、鈣、鎂、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如鐵、鋅、硒等。 ? 除少數(shù)懸浮型細(xì)胞外，絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞需附著在適宜的附著物上方能生長?，F(xiàn)今，常用的細(xì)胞培養(yǎng)附著物有： ? 玻璃 是最常用的附著物，有透明、便于觀察、易洗滌和能反復(fù)使用等優(yōu)點，缺點是易破碎。 ? 微載體 是由聚苯乙烯、葡聚糖和聚丙烯酰胺制成的直徑為 100至 300微米的小球體，細(xì)胞貼附表面積大，能夠融合貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的特點。動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的抑制物主要有： ? 乳酸 可以螯合鈣離子，抑制谷氨酰胺酶，增加培養(yǎng)液的滲透壓，并使pH下降。 ? CO2 在培養(yǎng)液中過度積累會使 pH下降，同時也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。隨時掌握細(xì)胞動態(tài)變化，以便做 換液 或 傳代 處理；如 發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時采取措施 。污染主要來于 培養(yǎng)用液 、 培養(yǎng)基 、 血清 或 操作時 由 空氣播散 所致。 ? 霉菌污染 易于發(fā)現(xiàn)，如培養(yǎng)液中長出了各種菌落，肉眼可見，不難確認(rèn)。 ? 經(jīng)常發(fā)生和難以發(fā)現(xiàn)的是支原體污染 。 PPLO污染后的細(xì)胞仍然能生存，甚至無明顯變化，有時導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生不同程度的病理改變。 ? 用一般恒溫箱培養(yǎng)時，隨細(xì)胞生長時間延長，二氧化碳（ CO2）積累增多，在超出緩沖范圍后，營養(yǎng)液 酸化變黃 ，此時如不調(diào)節(jié) pH，對細(xì)胞會發(fā)生不利影響，嚴(yán)重時細(xì)胞脫落死亡。更換營養(yǎng)液的時間，可依營養(yǎng)物的消耗而定，細(xì)胞生長旺盛時 23d換一次，生長緩慢時 34d亦可。 ? 細(xì)胞機(jī)能不良時 ? 輪廓增強(qiáng) ， 胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其它顆粒狀物 ， 細(xì)胞之間空隙加大 ， 細(xì)胞形態(tài)常變得不規(guī)則和失去原有特點 ，如上皮細(xì)胞會變成纖維細(xì)胞等。常用的技術(shù)方法有兩種： ? 用 血細(xì)胞計數(shù)板人工計數(shù) ，是最經(jīng)濟(jì)的方法； ? 用 細(xì)胞計數(shù)器 ，比較昂貴。紐巴氏血細(xì)胞計數(shù)板有兩個計算室，各室劃分為 9個大格，每個大格的平均面積為1mm2。在計算室四角的 4個大方格又各劃分為 16個中方格。每個中方格內(nèi)又劃分為 16個小方格。 用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)的步驟 ? S1[準(zhǔn)備計數(shù)板 ]: 用無水酒精或 95%酒精清潔計數(shù)板及專用蓋玻片將，讓后用綢布輕輕擦拭，并蓋玻片放于計算室上。 ? S3[加樣 ]: 用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液，加樣時不要溢出蓋玻片也不能溢入兩側(cè)的玻璃槽內(nèi)，也不要過少或帶氣泡。對好焦距進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，計中央大方格內(nèi)的細(xì)胞，可依中方格順序計數(shù)中方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，避免計數(shù)重復(fù)或漏計。 用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)的步驟 ? 按照計算公式計算細(xì)胞數(shù) ? 中央大方格的面積為 1mm2，室深為 ，則體積為 。 ? 所以計算公式為： ? 紅細(xì)胞計數(shù)：細(xì)胞數(shù) /每毫升原液 =5個中格細(xì)胞數(shù)之和 5 104 稀釋倍數(shù) ? 白細(xì)胞計數(shù)：細(xì)胞數(shù) /每毫升原液 =（ 4個中格細(xì)胞數(shù)之和 /4） 104 稀釋倍數(shù) ? 注意事項 ? 消化單層細(xì)胞時，務(wù)求細(xì)胞分散良好，制成單細(xì)胞懸液；取樣前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液；鏡下計數(shù)時， 遇見 2個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算 ，如 細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明消化不充分應(yīng)重新制備細(xì)胞懸液 ； ? 鏡下技術(shù)時，若細(xì)胞數(shù)少于 20個 /10mm2或多于 500個 /10mm2，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液； ? 每個細(xì)胞懸液至少滴樣兩次求平均值 。用活細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞中的百分比表示其活力。按 細(xì)胞懸液和染液 9： 1比例 混合后，4min計數(shù)， 若時間過長，活細(xì)胞亦可受損而著色 。 ? 苯胺黑 %苯胺黑（溶于 Hanks液），用細(xì)胞懸液作 10倍稀釋，稍放置后鏡檢。黑色細(xì)胞為死細(xì)胞 。 這種色素易同蛋白質(zhì)結(jié)合，故須把血清洗凈 。
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