【正文】 科發(fā)展和本國農(nóng)作物病害的特點，立足于創(chuàng)新、突出研究重點、發(fā)揮自身優(yōu)勢，做出跨越式的發(fā)展并提升我國在本領域的研究水平和地位。 圍繞國際學科發(fā)展趨勢，以系統(tǒng)闡明植物包括重要糧食作物的免疫機理為目標，結合我國轉(zhuǎn)基因新品種培育中抗病分子育種這一重大需求。 2. 從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和學科發(fā)展中提煉關鍵科學問題，創(chuàng)建 特色研究體系 。為此，在相關領域設置了 6 個相互交叉的研究課題，并 把主要研究方向集中在水稻和麥類抗病分子機理，推動以水稻抗病性為主要模式體系 的轉(zhuǎn)換，建立我國特色的植物免疫和作物抗病育種基礎理論的前沿領域。國際上植物免疫的研究已經(jīng)進入更高層次的研究領域。尤其是 植物免疫的表觀遺傳機制是植物生物學的新興研究領域，存在若干重要的科學問題亟待闡明?？共?RNA 沉默 的 研究也主要 集中 在擬南芥和煙草上 。以植物免疫的表觀遺傳機制為主線，從模式植物到我國主要糧食作物，結合項目各課題組已建立起來、各具特色的實驗體系和工作平臺， 拓展表觀遺傳機制調(diào)控抗病（病毒、細菌和真菌）應答研究領域。 4. 利用和創(chuàng)制特色研究材料。并以已經(jīng)定位克隆的、有自主知識產(chǎn)權的一批重要廣譜抗病基因如 xa1 Xa30， Pigm、 Pid ROD OsNPR 等為研究的重要出發(fā)點， 緊密結合作物遺傳育種 ，建立作物抗病分子設計的理論、應用基礎和共性技術體系。本項目 廣泛采用 ‘組學 ’和 ‘復雜性狀 ’的研究方法，利用正向、反向遺傳學和表觀遺傳學，并結合生物信息學、蛋白組學、現(xiàn)代生物化學等研究技術，系統(tǒng)剖析 作物對重要病原菌的識別機制與應答的信號網(wǎng)絡，并整合作物抗病 性與產(chǎn)量性狀的互作途徑， 創(chuàng)建抗病分子設計育種體系。 6. 新的目標視野。 創(chuàng)新性研究成果（如水稻廣譜抗病性基因）的應用有可能為農(nóng)作物抵 抗類似于水稻紋枯病這樣的疑難病害做出重大貢獻。 7. 新的研究隊伍建設。 （四）取得重大突破的可行性分析 在植物免疫和作物抗病性研究領域，雖然要全面超越國際一流研究水平還要進行長期、艱苦的研究與探索，但是本項目的實施也存在諸多有利因素，其中包括研究資源、研究基礎、人才隊伍和儀器裝備等幾方面的有利條 件，本項目具備圓滿完成預定計劃的能力和工作條件。 2. 具有豐富的研究資源 。這為本項目通過功能基因 學的方法，研究不同農(nóng)作物品種抗病分子機理，在以水稻為主的重要農(nóng)作物的抗病分子機理研究，可以做出創(chuàng)新性和有特色的研究成果。 近年來植物分子生物學研究飛速發(fā)展，擬南芥及水稻基因組已相繼完成測序， 小麥基因組 454 高通量序列的豐富， 基因定位克隆已經(jīng)實現(xiàn)日常化。這些成熟的技術平臺為順利開展本項目并完成目標提供了可靠的保障。通過承 擔國家 863 計劃、國家基金重大研究計劃和重點項目、國家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大項目等多項研究的積累，本項目組各個課題已經(jīng)在科學研究思路、實驗材料、研究實驗體系、數(shù)據(jù)分析能力、國際學術交流等方面打下了較好的研究基礎。項目的實施將依托 7 個國家和 3個部門重點實驗室（詳見工作條件部分），具有先進的儀器設備和國內(nèi)一流的工作條件。 5. 研究隊伍具備國際競爭力 。在過去數(shù)年間，本項目骨干作為第一或通訊作者的多篇研究論文發(fā)表于國際重要學術期刊如 Cell 及其系列 , Nature 系列 , Science, Plant Cell, PNAS, Genome Research, EMBO J, Cell Host amp。具備進行創(chuàng)新研究的團隊基礎和較強的國際競爭實力。這些條件均對本項目的開展是一個有力的支持。 2. Xoo 鞭毛蛋白基因 /解毒蛋白基因及突變體的克隆 ； 構建 Xoo/Xoc 鞭毛蛋白等 PAMPs 編碼基因的缺失突變體；構建多個水稻基因變量表達的雙元載體 ； 效應蛋白基因轉(zhuǎn)基因 ； 建立純化EPS 天然寡聚體的技術平臺以 及 EPS寡聚體生物活性檢測系統(tǒng)。 4. 利用γ ray 輻射誘變和 EMS 化學誘變抗病品種 GM4(Pigm)，篩選 Pigm 基因的抑制因子 spi（ suppressors of Pigm） ；利用體內(nèi)和體外方法篩選水稻 EMS誘變 F2 群體，獲得對 Xoo LPS 敏感性發(fā)生改變的突變材料，創(chuàng)建該突變材料的 分離群體并開始進行圖位克隆 ； 。 5. 采用激光顯微切割，結合禾谷鐮孢活體熒光標記、基因組芯片等，揭示宿主作物細胞在禾谷鐮孢侵染中、晚期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；研究宿主作物 禾谷鐮孢互作細胞學過程 ； 病毒侵染擬南芥，microarray 高通量表觀遺傳途徑相關蛋白基因表達檢測；抗病 TGS 蛋白目標基因篩選、及其表達譜檢測。 2. 明確兩種 Xoo/Xoc PAMPs 突變體對水稻致病性的變化；明確 Xoo/Xoc 鞭毛蛋白和另外一種 PAMPs誘導水稻的防御反應的能力；構建 35 個水稻轉(zhuǎn)基因載體 。 4. 得到宿主作物細胞在禾谷鐮孢侵染中、晚期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組 ； 利用基因組方法分析 RDV病毒感染后水稻基因組的變化。 6. 篩選并獲得水稻 LPS 非敏感型突變體；建立篩選 LPS 結合蛋白的生化體系并開展篩選工作 。 8. 構建水稻 OsNPR1 基因的遺傳學研究株系并進行表型鑒定；獲得水稻抗ROD 基因轉(zhuǎn)基因功能驗證材料；定位克隆 2 個以上水稻抗白葉枯病基因或QTL； 發(fā)表關于 Pigm 基因功能的相關論文。 10. 獲得小麥 EDR1 和 EDR2 基因 各 1個 ； 克隆水稻 PID3 和小麥 Yr 研究內(nèi)容 預期目標 RDR1,RDR6,AGOs,PolIV,PolV,DCL2 等 ；利用酵母雙 雜交方法，篩選受 RDV 病毒侵染前后水稻基因表達譜的變化并對其進行生物信息學預測 。 RNAseq測序 ， 建立 mRNA 表達譜 。 9. 完成對 Pigm 基因的功能鑒定工作；水稻抗 ROD 基因的克隆；水稻抗白葉枯病基因或 QTL 的定位；小麥抗銹病 QTL 的定位工作；抗黃萎病相關基因的定位工作 ； 新型等位基因的克?。嚎寺∷?稻 PID3 基因以及小麥 YrYr18 和 Yr36 的新型等位基因 ； 小麥EDR1 和 EDR2 基因的獲得 ； 10. 構建 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體和Yr10Yr18Yr36 聚合載體（自然表達，即使用自身啟動子） ；開展 廣譜抗病品種的轉(zhuǎn)基因及分子育種工作，水稻抗病基因的分子標記聚合育種：利用基因標記，將水稻 xa Xa2 Pid2 和Pid3 基因轉(zhuǎn)育我國超級雜交稻的恢復系親本 9311 和明恢系列的品種；水稻 Pigm 與 Pi9 基因重組位點的創(chuàng)建； 小麥抗條銹病基因的分子標記聚合育種： 利用基因標記，將小麥Yr Yr18 和 Yr36 基因轉(zhuǎn)育我國小麥主產(chǎn)區(qū)品種“ 濟麥 19”和“ 鄭麥9023”。 11. 獲得一批廣譜抗病轉(zhuǎn)基因或分子育種品系； 獲得 1000 份攜帶水稻 PID3 或小麥 Yr Yr1 Yr36 等 基因 的材料。 13. 獲得有 10 萬個體的 F2 群體，篩選獲得鑒定 Pigm 和 Pi9 基因的菌株 23個，特異鑒別這兩個基因的 PCR 分子標記 23 個。 15. 申請專利 56 個。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白的分離純化及生化分析；效應蛋白對宿主信號通路的作用分析 ； 抗病蛋白不同結構域間互作分析，及這種互作與蛋白功能和下游信號通路之間的關系分型；構建大麥表皮細胞富集百分病菌轉(zhuǎn)錄本的酵母雙雜交 cDNA 文庫的構建。 4. 鑒定 BBI1 （ E3 ligase ），OsRAR1,OsNPR1,OsSGT1 的感病純合突變單株 ,分別與含有 Pigm 轉(zhuǎn)基因日本晴株系雜交 。 6. 進行抗病 TGS 目標蛋白作用關鍵靶基因篩選、及其 DNA 的作用模式分析、同時進行病毒侵染關鍵靶基因表達譜改變分析； 探索病毒侵染對水稻包括miRNA在內(nèi)的內(nèi)源 RNAs表達的影響。 8. 鑒定及獲得帶有乙烯耐受基因的抗性水稻株系；分析在阻斷乙烯反應后對稻瘟病菌的抗病變化 。 利用microarray 等技術，分析 OsNPR1 基因介導的 SAR 與生長素信號途徑等之間1. 再分離鑒定 PTI途徑基因 12個 及 ETI途徑基因 12 個，并明確這些基因的功能。 2. 明確水稻 OsFLS2 對鞭毛蛋白的感知能力；獲得涉及 2 個基因的變量表達的突變體株系； 構建獲得 2 個水稻病原菌誘導表達的 cDNA 文庫。 4. 得到宿主作物細胞在禾谷鐮孢侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；揭示其與作物細胞本身能量、物質(zhì)代謝途徑交叉互作的結點 /關鍵分子。 6. 對 LPS 受體基因進行遺傳和物理定位；構建候選 LPS 結合蛋白的水稻遺傳學研究株系。 8. 鑒定與 RDV P2 蛋白互作的水稻蛋白并分析其可能的生化功能。 10. 完成 ROD 基因功能鑒定工作； 完成水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的功能鑒定；獲得 Pigm/ROD 的 supprosser 的穩(wěn)定突變；定位克隆一個抗銹病 QTL； 11. 分別獲得 410 個 xa5Xa21Pid2Pid3 或 Yr10Yr18Yr36 陽性的轉(zhuǎn)基因株系 410 個 。 9. ROD 基因功能的鑒定工作；水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的功能鑒定工作；新廣譜抗病基因（ QTL）的定位工作；抗銹病 QTL 的定位工作 ； 研究抗黃萎病相關基因。 10. 分別將 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體和 Yr10Yr18Yr36 聚合載體導入水稻品種明恢系列或小麥品種濟麥等系列。 的新 型設計抗病基因 25 個。 14. 發(fā)表 SCI 文章 1012 篇。 第 三 年 1. PTI 通路新基因的生化和分子生物學分析 ； PRR 受體蛋白互作蛋白的功能鑒定。 3. 對 bir1, snc1, snc2, snc4, mkk1 mkk2這5 個突變體做進一步的抑制子篩選，克隆更多的基因 ； 利用圖位 克隆和全基因組測序技術篩選到 SAR 突變體的突變位點 ； MEKK1 結合蛋白及 FLS2介導的磷酸化蛋白的功能驗證 。 4. 利用圖位克隆的方法鑒定 spi 基因。 5. 綜合運用 各種生物手 段具體研究禾谷1. 認識 PTI 途徑相關基因編碼蛋白的生化和分子生物學特性 ； 明確 ETI 途徑相關基因編碼的抗病蛋白的生理生化特性 ； 明確病原菌效應蛋白靶標基因的功能及分子特性。 3. 明確 12 個 RLKs、 WRKYs 或 ERFs 在水稻抗病性中的作用；篩選獲得一批與 RLK、 WRKY或 ERF互作的候選蛋白；初步確定 PTI 中受調(diào)控的基因。 5. 克隆到 1 個 Pigm 的抑制子 spi。 6. 構建關鍵靶基因過表達和敲除突變體，并進行病毒侵染性的分析 ； 研究水稻 RNA 干擾途徑對病毒侵染的抵抗作用 ； 實驗驗證小 RNA 與潛在靶標的調(diào)控關系；在水稻 dcl4 突變體中受Xoo 誘導的水稻小 RNA 的表達是否依賴 dcl4 基因。 8. 繼續(xù) ROD 基因研究工作 ； 水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的功能鑒定 ， 克隆 2個新的廣譜抗病基因（ QTL ） ；Pigm/ROD 的 supprosser 突變基因的定位工作 ； 新的抗銹病 QTL 的定位；繼續(xù)克隆抗黃萎病相關基因。 9. 評價 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體對水稻白葉枯病和稻瘟病的 抗性特征；評價 Yr10Yr18Yr36 聚合載體對小麥條銹病的 抗性特征。 10. 利用基因標記，繼續(xù)水稻 xa Xa2Pid2 和 Pid3 基因的回交轉(zhuǎn)育 。 和調(diào)控作用。 8. 分析候選水稻 LPS 受體及結合蛋白的功能及在病原識別和發(fā)育調(diào)控中的分子功能。 10. 研究 P2蛋白影響 GA合成途徑的關鍵因子 及影響機制 。 12. 確定 EDR1 和 EDR2 轉(zhuǎn)基因在受體基因組的整合和表達模式；獲得具有新型抗性特征的基因 12 個 ； 確定多基因聚合載體在受體基因組的整合和表達模式； 確定多基因聚合載體賦予受體植株的抗病特征。 14. 發(fā)表 SCI 收錄論文 1824 篇 。 研究內(nèi)容 預期目標 第 四 年 1. PTI 通路新基因在植物抗病途徑信號傳導途徑中作用及位置分析； PRR 受體蛋白互作蛋白下游信號通路研究。 3. 熒光互補與免疫共沉淀研究 PTI 基因網(wǎng)絡中至少 2 個蛋白間的相互作用；構建從酵母雙雜交或免疫 沉淀篩選到PTI 基因網(wǎng)絡中的重要組分的過量表達與 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株，人工接種鑒定其抗病性 。水稻 MAPK 上下游蛋白元件分析。 6. 采用激光顯微切割，基因組芯片等，揭示宿主作物細胞在活體 /半活體病原侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組 ； 通過分離、純化獲得活性寡聚體；應用分離到的活性 EPS 寡聚體處理擬南芥，接種丁香假單胞菌。 8. 闡明 LPS 結合蛋白和 LPS 受體的 信號轉(zhuǎn)導途徑及