流加發(fā)酵與高密度培養(yǎng)-閱讀頁
2025-01-27 15:29本頁面
【正文】 高細(xì)胞密度帶來的問題： 1. 底物對(duì)生長的限制或抑制 2. 產(chǎn)物或代謝副產(chǎn)物的抑制 3. CO2和熱量 4. 粘度增加、混合不充分 5. 氧的限制 當(dāng)細(xì)胞濃度超過 200g(DCW)L1時(shí)，培養(yǎng)液的粘度迅速增加，在220g(DCW)L1幾乎失去流動(dòng)性。 大腸桿菌 HCDC中乙酸的形成 ? 乙酸是大腸桿菌流入中心代謝途徑的碳超過生物合成的需要和產(chǎn)生能量超過細(xì)胞的容量時(shí)產(chǎn)生的。 ? 乙酸毒害作用的機(jī)理還未被闡明。 HCDC遇到的問題 ? 控制比生長速率在產(chǎn)生乙酸的臨界值以下 一般可通過控制限制性底物濃度控制比生長速率。 HCDC遇到的問題 減少乙酸合成的方法 ? 選擇合適的培養(yǎng)基 例如，甘油比葡萄糖吸收進(jìn)入細(xì)胞的速度要慢，可能會(huì)減少流入糖酵解途徑的碳，這會(huì)極大的減少乙酸的合成。 使用酸和堿調(diào)節(jié) pH而積累下來的鹽會(huì)使乙酸的毒害作用加強(qiáng)。 ? 因?yàn)檠醯娜芙舛群艿汀? HCDC遇到的問題 提高溶氧的方法有： ? 提高通氣速率和攪拌速度 ? 富氧空氣和純氧 ? 在加壓環(huán)境下培養(yǎng) 混合的限制 ? HCDC的另一個(gè)物理限制。 ? 靠近進(jìn)料口部分的細(xì)胞暴露在高濃度營養(yǎng)物中。 HCDC遇到的問題 有必要研究發(fā)酵罐中的攪拌模型，找到改善攪拌的方法。高 CO2分壓（ ） 會(huì)降低生長速率并刺激乙酸的生成。 這些問題可通過降低細(xì)胞比生長速率而部分的解決。 HCDC遇到的問題 溫度的影響 ? 把培養(yǎng)溫度從 37℃ 降到 26－ 30℃ ， 會(huì)降低營養(yǎng)吸收和生長速度 ， 因此會(huì)減少有毒副產(chǎn)物和代謝產(chǎn)生的熱量 。 ? 降低重組細(xì)胞溫度也有可能減少包含體形式的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生 。 HCDC遇到的問題 流加控制策略 有兩種主要的營養(yǎng)流加控制策略： ? 開環(huán)（無反饋）控制 ? 閉環(huán)（反饋 ）控制 ?補(bǔ)料方式是高細(xì)胞密度培養(yǎng)取得成功的關(guān)鍵因素。 ?產(chǎn)物形成會(huì)受各種補(bǔ)料策略的影響。 條件 預(yù)設(shè)參數(shù) 開環(huán)（無反饋）控制 流加控制策略 DO 溫度 pH 培養(yǎng)基 攪拌 壓力 流加 控制 無反饋控制的流加策略 ? 恒速流加 —— 以預(yù)先決定的 （ 恒定的 ） 速率流加營養(yǎng)物質(zhì) ， 比生長速率逐漸降低 。 可補(bǔ)償一些比生長速率的降低 ?？傻玫胶愣ǖ谋壬L速率。 ? 即時(shí) pH—— 主要碳源耗盡引起 pH上升時(shí)補(bǔ)加營養(yǎng)物質(zhì) 。 這一方法最為經(jīng)常用于控制比生長速率 。 反饋控制 流加控制策略 直接反饋控制 流加控制策略 底物濃度控制 —— 營養(yǎng)物質(zhì)流加速率直接由主要碳源的濃度控制 例如，使用一種在線葡萄糖分析儀控制發(fā)酵罐中的葡萄糖 。 ? 現(xiàn)在，通過控制乙酸的濃度低于抑制水平，大腸桿菌可以很容易的獲得大于 100g（ DCW） L1的細(xì)胞干重。因?yàn)樗唵吻也恍枰魏翁厥庋b置。 展望 ? 內(nèi)部的熒光色譜、熒光活性細(xì)胞分類和流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)以及 HCDC中的原位顯微鏡等現(xiàn)代監(jiān)控技術(shù)的在線聯(lián)合，將會(huì)提供更多高密度群體信息的細(xì)節(jié)。 ? 工業(yè)生產(chǎn)需要商業(yè)上可行的生物過程。 謝謝 !
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