腫瘤細胞培養(yǎng)技術林星石-閱讀頁
2025-06-03 01:25本頁面
【正文】 拔出口時要停留片刻， 縫合切口或用 醫(yī)用黏合劑涂抹切口。靜脈 或脾內追加免疫后 72~96h細胞融合。 單 克 隆 抗 體 制 備 一 .滋養(yǎng)細胞制備： 1. 機制： 不明，通常認為這類細胞釋放 一種或幾種生長因子，提供必要生長 條件。 ⑵ 75%乙醇浸泡 5~10min， 單 克 隆 抗 體 制 備 ⑶ 撕開腹部皮膚， 充分暴露腹腔， 提起 腹膜，剪開，吸管注入 5 ml無血清培基， 小心提動或輕揉腹膜， 吸出培基。通 常獲 2 106 ~ 5 106 只。 2. 培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期細胞（ 1 105 ~ 5 105/ml），按 1： 5 ~ 1： 10 稀釋傳代， 3天擴大培養(yǎng)，選生長狀態(tài)、形態(tài)好對數(shù)生長期細胞融合用。 單 克 隆 抗 體 制 備 三 . 免疫脾細胞懸液制備： 1. 免疫 BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。 3. 剪碎脾臟，注射器內芯研磨過 100目鋼篩， 平皿預先 2~3ml RPMI1640，移入圓底試管，補加適量培基，靜置 3~5分，取上 2/3懸液移入 50ml離心管，上述反復 2~3次。 單 克 隆 抗 體 制 備 四 . 50%PEG的準備： 融合前，稱 PEG（ mw = 4000) 2g，置小 瓶內，低壓消毒（ 8磅）， 15min, 取出立即 邊加邊搖加入 2ml完全培基，（內含 %ml二 甲基亞楓，以提高融合率），至完全混合， 4 ℃ 保存。要求 PEG現(xiàn)配，防止 PH變堿。用 SP2/0時，脾細胞：骨髓瘤細胞以 10： 1為好；用 NS1，脾細胞：骨髓瘤細胞以 5： 1為好。 4. 1 ml 吸管吸取 ml 37 ℃ PEG， 1 10 8 脾細胞 + ml PEG，邊加邊搖， 60s內加完， 輕搖 min。 單 克 隆 抗 體 制 備 注意： 第 1 min 加 1 ml。 第 3 min 加 ml。 第 5 min 加 5 ml。 離心： 1000r / min / 5min. 單 克 隆 抗 體 制 備 5. 移出上清，取少量 HAT小心吹散細胞，細 胞移入 HAT培基中，按免疫脾細胞 2 10 5 / 孔 /96孔， 加入 ml ~ ml/孔（已加入融合當天 制備的滋養(yǎng)細胞）， CO2 孵箱 37 ℃ 。 單 克 隆 抗 體 制 備 六 . 融合細胞觀察與換液： 1. 第 2~3天骨髓瘤細胞退化、核縮、碎裂， ?增生、吞噬碎片； 第 4~5天可見小堆 雜交瘤細胞生長。 2. 融合后 5~7天確認骨髓瘤細胞全部死亡， 毛細吸管吸出 ~ HAT， 換成同量 HT培基。 測定時間：融合后 10~15天，第２次換液 3 天后， ELISA、冰凍切片熒光技術等。 單 克 隆 抗 體 制 備 八 . 克隆化：有限稀釋法。 2. 向 24孔板加 ml/孔 HT，通常每個待克隆雜交瘤需 3－ 4孔。 4. 混勻第 1孔細胞計數(shù)。 6. 9－ 10天 測抗體，陽性孔轉 24孔板， 1－ 3天后第 2次 、 第 3次 克隆，直至陽性率 100%。 8. 細胞凍存：陽性雜交瘤盡早凍存。 ⑵ 建株后每株凍存 5－ 8管。 3. 單抗等電點測定 4. 單抗親和力測定
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鄂ICP備17016276號-1