【正文】 ，作為種子序列的延伸產(chǎn)物； 據(jù)種子序列的延伸產(chǎn)物，設(shè)計相關(guān)引物，并且到相應(yīng)的棉花材料中檢驗延伸序列的真實性。 目的基因的生物信息學分析 參考 13 文獻的方法 [13]進行各個基因的生物信息學分析，相關(guān)工具軟件、網(wǎng)址和方法對 GbEDS1 序列進行序列分析。 圖 1 棉花根部總 RNA電泳圖 Agarose gel electrophoresis of total RNA from G. barbadense L 28S18S GbEDS1 基因編碼區(qū)片段的克隆 以 黃萎病菌 誘導(dǎo)的 Pima9053 根部總 RNA 為模板 ， 通過 RTPCR， 擴增出約1140bp 大小的片段 （ 圖 2），與預(yù)期大小一致 。 將陽性克隆的測序結(jié)果與 NCBI 數(shù)據(jù)庫做 BlastN 比對，結(jié)果表明所獲片段與楊樹和葡萄 EDS1 同源性分別為 64%和%，初步推斷此 cDNA 片段是棉花 GbEDS1 基因編碼區(qū)的部分序列。12:PCR產(chǎn)物 . GbEDS1 基因 5′端和 3′端序列的克隆 通過 5′RACE和 3′RACE反應(yīng)分別獲得了約 1500bp的 5′端片段和 750bp的 3′端片段 （ 圖 3），通過 pMD19T載體克隆測序后 ， 經(jīng)序列拼接獲得 GbEDS1基因 cDNA全長序列。 13:PCR產(chǎn)物 . GbEDS1 開放讀碼框的克隆 基于全長 cDNA 序列設(shè)計引物 ， PCR 擴增后 獲得了 1840bp 左右的目的片段 （ 圖4）， 經(jīng)測序分析此全長序列與拼接序列完全相同。 1: PCR產(chǎn)物 GbEDS1 的生物信息學分析 GbEDS1 的氨基酸序列分析 將 GbEDS1 基因編碼區(qū)的 1848 個核苷酸譯成氨基酸序列后，用 DNAstar 的Protean 分析：分子量為 KD，理論等電點為 。 GbEDS1 的信號肽分析 使用 SignalP信號肽預(yù)測工具 該基因無信號肽序列 ，利用隱馬爾可夫 模型（ hidden markov models, HMM）算法 ， 分析該基因同樣無信號肽序列（圖 5）。 圖 6 GbEDS1的氨基酸跨膜區(qū)段預(yù)測 Fig. 6 Prediction of transmembrance region of GbEDS1 amino acid sequence GbEDS1 的亞細胞定位預(yù)測 利用 PSORT 網(wǎng)站 PSORT Prediction of Protein Localization Sites version (WWW) （ GbEDS1 基因進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示（圖 7）， GbEDS1 蛋白可能位于細胞微體（過氧化物酶體）上。使用 espasy提供的 ScanProsite resules viewer 對 GbEDS1 基因進行蛋白質(zhì)的模體位置分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該基因包含 1 個脂肪酶 絲氨酸活性位點（ Lipases, serine active site）， 3 個酪氨酸激酶磷酸化位點（ Tyrosine kinase phosphorylation site）， 3 個 N糖基化位點（ Nglycosylation site）， 6個蛋白激酶 C 磷酸化位點（ Protein kinase C phosphorylation site）， 5 個 N 端肉豆蔻?；稽c（ Nmyristoylation site）， 11 個酪蛋白激酶 II 磷酸化位點（ Casein kinase II phosphorylation site）， 1 個依賴 cAMP 和 cGMP 蛋白激酶磷酸化位點（ cAMPand cGMPdependent protein kinase phosphorylation site）。 表 1 棉花 GbEDS1基因與 5個其他物種 EDS1序列的同源分析 Table 1 Sequence homology analysis of EDS1 in cotton and 5 other species 3 討論 本研究根據(jù)不同物種的 EDS1 核酸保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，通過 RTPCR 和RACE 技術(shù)相結(jié)合的方法，從海島棉 Pima9053 中克隆了與 毛果楊 同源的 海島棉GbEDS1 基因的 cDNA 及開放閱讀框序列（ Open reading frame， ORF） 。 GbEDS1 與 毛 果楊和葡萄的 EDS1基因的同源性較高，分別為 64%和 %。 有關(guān) GbEDS1和棉花抗黃萎病的關(guān)系有待進一步驗證。 物種名稱 E D S1 基因序列號 與棉花 G bE D S1 同源百分比 毛果楊 XM 002322106 64% 葡萄 E F 5511 59 62. 2% 擬南芥 NM 114678 54. 4% 大豆 F J 5175 62 58. 8% 番茄 A Y 7961 14 60. 9% 參考文獻 [1] Kumria R, Sunnichan V G, Das D K, et al. High frequency somatic embryo production and maturation into normal plants in cotton (Gossypium hirsutum) through metabolic stress[J]. Plant Cell Rep, 2020, 21: 635639. [2] 周兆華 , 張?zhí)煺?, 潘家駒 , 等 . 大麗輪枝菌在棉花品種上的致病力分化研究 [J].中國農(nóng)業(yè)科學， 2020, 33 (2): 5157． [3] 簡桂良 , 盧美光 . 棉花抗黃萎病品種選育方法探討 [J]. 植物病理學報 , 2020, 34(4): 356360. [4] 潘家駒 , 張?zhí)煺?. 黃萎病抗性遺傳研究 [J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報 , 1994, 17(3): 818. [5] Falk A, Feys B J, Frost L N, Jones J D G, Daniels M J, and Parker J E. EDS1, an essential ponent of R genemediated disease resistance in Arabidopsis has homology to eukaryotic lipases [J]. Proc Natl Acad Sci USA 96, 1999, 32923297. [6] Jirage D, Tootle T L, Reuber T L, Frost L N, Feys B J, Parker J E, Ausubel F M, and Glazebrook J. Arabidopsis thaliana PAD4 encodes a lipaselike gene that is important for salicylic acid signaling [J]. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96:1358313588. [7] Goodman R N, Novacky A J. The hypersensitive reaction in plants to Pathogenes [M]. APS Press, 1994. [8] Fradin E F, Zhang Z, Juarez Ayala J C, Castroverde C D, Nazar R N, Robb J, Liu C M, Thomma B P. Geic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1[J]. Plant Physiol, 2020, 150: 320332. [9] Expression of RPS4 in tobacco induces an AvrRps4independent HR that requires EDS1, SGT1 and HSP90 [J]. Plant Science, 2020, 10: 213224. [10] Fei Gao, Xiao Meishu, Mohammad, Babar Ali, Susanne Howard, Nan Li, Patrick Winterhagen, Wenping Qiu, Walter Gassmann. A functional ortholog is differentially regulated in powdery mildew resistant and susceptible grapevines and plements an Arabidopsis EDS1 mutant [J]. Planta, 2020, 231:10371047. [11] Feys B J, Moisan L J, Newman M A, and Parker J E. Direct interaction between the Arabidopsis disease resistance signaling proteins, EDS1 and PAD4[J]. EMBO, 2020, 20:54005411. [12] Rust