【正文】 愈萬人，創(chuàng)傷治愈 ，其他遺傳疾病萬人，其他遺傳疾病 2023人人，按每人，按每人 10000美元計算，醫(yī)藥費高達美元計算，醫(yī)藥費高達 58億美元。223。據(jù)。轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞能否在體內(nèi)進行增殖，等等。）基因治療。 要將目的基因轉(zhuǎn)移進受體細(xì)胞，首先必須選擇合要將目的基因轉(zhuǎn)移進受體細(xì)胞，首先必須選擇合適的基因載體。223。常用的方法是將病毒作為基因轉(zhuǎn)移的載體。 由病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法有兩種：由病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法有兩種：▲ 重組反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移；重組反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移；▲ 重組重組 DNA病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。下面介紹基因治療中常用的病毒載體：下面介紹基因治療中常用的病毒載體：一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體（一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體（ retrovirus vector））二、腺病毒載體（二、腺病毒載體（ adenovirus vector， AV vector））三、腺病毒相關(guān)病毒載體（三、腺病毒相關(guān)病毒載體（ adeno associated virus，AAV））四、重組痘苗病毒載體（四、重組痘苗病毒載體（ vaccinia virus， VV））五、單純皰疹病毒載體（五、單純皰疹病毒載體（ herpes simplex virus， HSV））六、染色體外自主復(fù)制載體六、染色體外自主復(fù)制載體一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體（一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體（ retrovirus vector））為單鏈正鏈為單鏈正鏈 RNA病毒，包括：病毒，包括：▲雙表達載體（雙表達載體（ dual expression vector， DE vector））▲內(nèi)部啟動子載體（內(nèi)部啟動子載體（ internal promoter vector，IP vector））▲自失活載體自失活載體反轉(zhuǎn)錄病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移的載體具有以下優(yōu)點：反轉(zhuǎn)錄病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移的載體具有以下優(yōu)點：①① 能穩(wěn)定地將能穩(wěn)定地將 DNA插到宿主基因組的隨機位點上，對宿插到宿主基因組的隨機位點上，對宿主基因來說，整合是隨機的，而對病毒基因組來說，主基因來說，整合是隨機的，而對病毒基因組來說，整合是精確的，也就是說整合的病毒整合是精確的，也就是說整合的病毒 DNA結(jié)構(gòu)是已知結(jié)構(gòu)是已知的；的；②② 能高效地感染宿主細(xì)胞，可以將遺傳信息傳遞給大量受能高效地感染宿主細(xì)胞，可以將遺傳信息傳遞給大量受體細(xì)胞，細(xì)胞感染率可達體細(xì)胞，細(xì)胞感染率可達 100% ；；③③ 反轉(zhuǎn)錄病毒的侵染范圍非常廣泛，可以浸染不同的生物反轉(zhuǎn)錄病毒的侵染范圍非常廣泛，可以浸染不同的生物種和細(xì)胞類型；種和細(xì)胞類型；④④ 整合的原病毒在宿主基因組中比較穩(wěn)定，而且拷貝數(shù)目整合的原病毒在宿主基因組中比較穩(wěn)定，而且拷貝數(shù)目較低；較低；⑤⑤ 用反轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動物細(xì)胞，對宿主細(xì)胞沒有毒性用反轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動物細(xì)胞，對宿主細(xì)胞沒有毒性作用；作用；⑥⑥ 反轉(zhuǎn)錄病毒中包裝的外源反轉(zhuǎn)錄病毒中包裝的外源 DNA序列可以達到序列可以達到 10 kb。病毒。用它作載體治療比較容易控制。 為正鏈為正鏈 DNA或負(fù)鏈或負(fù)鏈 DNA→ 形成雙鏈形成雙鏈 DNA。其安全性較好，其本身不具有致病性。 基因組大小為基因組大小為 187 kb，為雙鏈，為雙鏈 DNA病毒。223。既能感染分裂細(xì)胞，又能感染非分裂細(xì)胞。 為雙鏈為雙鏈 DNA病毒，基因組大小為病毒，基因組大小為 152 kb。 HSV的特點：的特點：①① 十分了解十分了解 HSV的基因組序列；的基因組序列；②② 可容納可容納 30 kb外源基因；外源基因；③③ 宿主細(xì)胞范圍廣泛；宿主細(xì)胞范圍廣泛；④④ 重組重組 HSV在體外培養(yǎng)能得到較高的滴度；在體外培養(yǎng)能得到較高的滴度；⑤⑤ 具有嗜神經(jīng)性，它可從外周神經(jīng)系統(tǒng)進入中樞具有嗜神經(jīng)性，它可從外周神經(jīng)系統(tǒng)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且在神經(jīng)元中潛伏下來，即病毒神經(jīng)系統(tǒng)，并且在神經(jīng)元中潛伏下來，即病毒的部分基因保持轉(zhuǎn)錄活性，但卻不影響神經(jīng)元的部分基因保持轉(zhuǎn)錄活性，但卻不影響神經(jīng)元行使正常功能?！?RV載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體；載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體；▲ AV載體：腺病毒載體；載體：腺病毒載體；▲ HSV載體：單純皰疹病毒載體；載體：單純皰疹病毒載體；▲ AAV載體：腺病毒相關(guān)病毒載體。六、染色體外自主復(fù)制載體六、染色體外自主復(fù)制載體223。作用。 隨機整合隨機整合 →→ 外源外源 DNA插入的位置不同插入的位置不同 →→ 插入突插入突變、基因失活、沉默基因激活（如原癌基因）變、基因失活、沉默基因激活（如原癌基因） →→嚴(yán)重后果。223。為克服這些缺陷，正在研究能在染色體外治療。自主復(fù)制的載體。 而很多情況下，基因治療的靶細(xì)胞正是那些快速而很多情況下，基因治療的靶細(xì)胞正是那些快速增殖的細(xì)胞。①① 哺乳動物人工染色體哺乳動物人工染色體? mammalian artificial chromosome， MAC，應(yīng)具備哺，應(yīng)具備哺乳動物染色體的全部特征，即有自主復(fù)制序列，端粒乳動物染色體的全部特征，即有自主復(fù)制序列，端粒和著絲粒。迄今為止還沒有得到可用于克隆外源基因的含有哺乳動物染色體的復(fù)制起始位點、端粒和著絲的含有哺乳動物染色體的復(fù)制起始位點、端粒和著絲粒的人工染色體。②② 來源于來源于 EB病毒的載體病毒的載體222。 基因組基因組 172 kb，含有，含有 84個個 ORF和反向末端重復(fù)序列。222。在，因而可以用于對快速增殖細(xì)胞的基因治療。 利用病毒載體與細(xì)胞的表面受體的相互認(rèn)別把外利用病毒載體與細(xì)胞的表面受體的相互認(rèn)別把外源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。源基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。二、化學(xué)方法二、化學(xué)方法①① DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 ———— 是指用磷酸鈣微量沉淀是指用磷酸鈣微量沉淀外源外源 DNA，然后與靶細(xì)胞混合；靶細(xì)胞攝入沉淀，然后與靶細(xì)胞混合；靶細(xì)胞攝入沉淀物，外源基因就被結(jié)合進核內(nèi)，與染色體發(fā)生整物，外源基因就被結(jié)合進核內(nèi)，與染色體發(fā)生整合。然后根據(jù)外源基因中選擇基因的特性對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進行篩選。②② 染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 ———— 就是先將供體細(xì)胞用就是先將供體細(xì)胞用秋水仙素處理使其染色體固縮、破碎，用差速離秋水仙素處理使其染色體固縮、破碎，用差速離心分離法分離出染色體，然后將染色體與受體細(xì)心分離法分離出染色體，然后將染色體與受體細(xì)胞混合，部分染色體被吞噬入細(xì)胞質(zhì)，斷裂成小胞混合，部分染色體被吞噬入細(xì)胞質(zhì)，斷裂成小片段后，一部分片段可以進入核內(nèi)，與染色體發(fā)片段后，一部分片段可以進入核內(nèi)，與染色體發(fā)生整合。? 化學(xué)方法轉(zhuǎn)移基因的效率很低。三、物理方法三、物理方法①① 電穿透法電穿透法 ———— 是借助電流使是借助電流使 DNA直接穿過細(xì)胞膜直接穿過細(xì)胞膜，從而轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。（還未應(yīng)用到基因治療中）②② 顯微注射法顯微注射法 ———— 是直接將外源基因注射入細(xì)胞中是直接將外源基因注射入細(xì)胞中，這種方法的操作難度大，只能用在易固定且個，這種方法的操作難度大，只能用在易固定且個體較大的細(xì)胞上。應(yīng)用到生殖細(xì)胞涉及到倫理問題，故也不能臨床應(yīng)用到基因治療中。第四節(jié)第四節(jié) 基因治療的方式基因治療的方式223?；蛑委煹陌屑?xì)胞：體細(xì)胞；生殖細(xì)胞。 體細(xì)胞基因療法（體細(xì)胞基因療法（ somatic cell gene therapy）） ———— 將遺傳物質(zhì)引入人的體細(xì)胞進行基因治療的方將遺傳物質(zhì)引入人的體細(xì)胞進行基因治療的方法為體細(xì)胞基因療法。223。因療法。 美國政府在美國政府在 1985年已規(guī)定基因治療的研究只能限年已規(guī)定基因治療的研究只能限于體細(xì)胞。目前有目前有 3種基因治療方式：種基因治療方式：▲ 體外體外 原位基因治療；原位基因治療；▲ 體內(nèi)基因治療；體內(nèi)基因治療；▲ 反義基因治療。一、體外一、體外 原位基因治療（原位基因治療（ ex vivo gene therapy））①① 從患者體內(nèi)取出帶有基因缺陷的細(xì)胞并培養(yǎng)；從患者體內(nèi)取出帶有基因缺陷的細(xì)胞并培養(yǎng)；②② 通過基因轉(zhuǎn)移進行遺傳修正；通過基因轉(zhuǎn)移進行遺傳修正；③③ 將經(jīng)過遺傳修正的細(xì)胞進行選擇和培養(yǎng)；將經(jīng)過遺傳修正的細(xì)胞進行選擇和培養(yǎng)；④④ 將修正后的細(xì)胞通過融合或移植的方法轉(zhuǎn)入患者將修正后的細(xì)胞通過融合或移植的方法轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)。二、體內(nèi)基因治療二、體內(nèi)基因治療223。接轉(zhuǎn)入病人的某一特定組織中。 人們開始研究利用溫和病毒載體將修正基因直接人們開始研究利用溫和病毒載體將修正基因直接運送到人體細(xì)胞內(nèi)而進行基因治療的方法。（注入到組