細(xì)胞工程基本技術(shù)ppt課件-在線瀏覽
2024-10-22 20:20本頁面
【正文】 適用于消毒量大和不適于做高壓或?yàn)V過的用品。布類、膠塞、金屬器械、玻璃器皿及某些培養(yǎng)用液都可用此法消毒滅菌。布類、玻璃制品、金屬器械等為 15磅 (12l℃ )20分鐘 。 ? ４、干熱滅菌 ? 主要適用于玻璃器皿的消毒滅菌。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱消毒法。 玻璃濾器適用于各種培養(yǎng)液的濾過除菌 。 微孔濾膜濾器 ， 應(yīng)選用孔徑為 除菌 。 （ 二 ） 化學(xué)消毒法 １ 、 消毒劑 細(xì)胞培養(yǎng)室的工作面 、 家具 、 墻壁 、 地面和空氣等可用消毒劑進(jìn)行滅菌處理 。 甲醛是一種光譜滅菌劑 ， 其水溶液和氣體對各種細(xì)菌 、 芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用 。 ? 最常用的抗生素為青霉素、鏈霉素和慶大霉素等。 六 、 污染檢測與控制 污染 ：一切與培養(yǎng)無關(guān)的雜質(zhì) （ 微生物 、 化學(xué)物 、 細(xì)胞等 ） 進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng) ， 影響培養(yǎng)物的正常生理機(jī)能 。 (一 )微生物污染的途徑 空氣 、 器材 、 操作 、 血清和組織樣本等 。顯微鏡下觀察可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，細(xì)胞表面和周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞停止生長、中毒、崩解死亡。 ? 用青霉素、鏈霉素可預(yù)防細(xì)菌的污染 ? 真菌的污染檢測與控制 ? 常見污染真菌有煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等。顯微鏡下可見細(xì)胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀、管狀及樹枝狀菌絲。 ? ? 支原體的污染檢測與控制 支原體的污染是一個常見而棘手的問題，外觀上看不出明顯的變化，實(shí)際上或多或少的影響到細(xì)胞的眾多機(jī)能?？赏ㄟ^支原體培養(yǎng)、PCR及電鏡觀察等方法進(jìn)行檢測。 C ? 病毒的污染檢測與控制 ? 病毒的污染主要是通過 DNA的整合，改變培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)性狀，影響細(xì)胞的生長或干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 ? 細(xì)胞交叉污染及檢測 ? 在培養(yǎng)的細(xì)胞中混雜有其它細(xì)胞，從而對培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生形態(tài)或生長特性等方面的影響。 ? 有效防治采取的措施： 1）嚴(yán)格操作，器具分明，空間隔離； 2）細(xì)胞的取放嚴(yán)禁接觸培養(yǎng)液瓶口； 3）對培養(yǎng)的細(xì)胞要有充足的儲備。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的無菌，防止污染。 （ 一 ） 培養(yǎng)前的準(zhǔn)備 要充分做好培養(yǎng)前的實(shí)驗(yàn)用品準(zhǔn)備工作 ， 根據(jù)研究內(nèi)容的要求進(jìn)行物品清點(diǎn)包裝 ， 注明標(biāo)簽后滅菌 、 烤干備用 。 （ 二 ） 培養(yǎng)室和超凈工作臺的消毒 工作面先用新潔爾滅擦拭一遍后，打開紫外線燈滅菌，用 30W紫外線燈管直接照射 20— 30分鐘。 超凈工作臺要用 75％酒精擦拭。 （ 三 ） 洗手和著裝 原則上與外科手術(shù)洗手相同：先用肥皂刷洗手和前臂 ， 再用流水沖洗 ， 然后用 ％ 新潔爾滅或 75％灑精棉球擦洗 。 （ 四 ） 無菌培養(yǎng)操作 在無菌條件下操作時，首先要點(diǎn)燃酒精燈，此后一切操作，如安裝吸管橡皮頭、打開瓶塞、使用吸管等都要經(jīng)過火焰燒灼，或在近火焰處進(jìn)行（ 火焰消毒） 。燒過的用具要待冷卻后才能挾取組織，以免造成組織損傷。 ? 不能用手觸及器皿的無菌部分，如已接觸，要更換或用火焰燒灼觸及部。 培養(yǎng)液等不要過早開瓶，不要長時間直立暴露開口，以免增加污染機(jī)會。 八、顯微技術(shù) ? 各種顯微鏡技術(shù) ? 同細(xì)胞生物學(xué)要掌握原理與應(yīng)用 九、細(xì)胞觀察與分析 ? 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，要及時觀察和了解生長增殖狀況，包括新生、增殖、消亡等各種狀態(tài)的時間參數(shù)、細(xì)胞數(shù)量、分布位置等指標(biāo)，以及體外因素對這些指標(biāo)的調(diào)節(jié)機(jī)制。廣義的細(xì)胞動力學(xué)還包括其它的細(xì)胞運(yùn)動及其原理的研究。 ? ? 細(xì)胞生長曲線 ? 生長曲線是反映培養(yǎng)細(xì)胞的時間與培養(yǎng)細(xì)胞濃度之間關(guān)系的曲線。 有絲分裂指數(shù)的測定 在一群細(xì)胞中 ， 進(jìn)入分裂期細(xì)胞所占該群細(xì)胞的百分率 ， 即為有絲分裂指數(shù) 。 分裂細(xì)胞數(shù) 分裂指數(shù) = 100% 細(xì)胞總數(shù) 細(xì)胞貼壁率 又 稱接種存活率 ， 貼壁附著生長的細(xì)胞狀況直接反映細(xì)胞的生存能力 。 基本步驟 ? 細(xì)胞培養(yǎng) ? 消化細(xì)胞計(jì)數(shù) ? 種植 60 mm 培養(yǎng)皿（ 70 X104 個細(xì)胞 /皿） ? 藥物處理細(xì)胞 ? 收細(xì)胞（胰蛋白酶消化 培養(yǎng)基終止） ? 2022轉(zhuǎn) /分 離心 10min ? 去上清液 PBS重懸，重復(fù) 6的步驟 ? 去上清加入 100 ul 1mg/mlPI 和 100ul 1mg/ml RNase A, 避光處理 30min ? 流式細(xì)胞儀檢測 MTT比色法測定細(xì)胞活力 活細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體脫氫酶活性，可將染料MTT還原為難溶的紫色結(jié)晶物沉積在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)酸性異丙醇溶解后呈現(xiàn)的色度可反映出生活細(xì)胞的代謝水平。
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