基因工程：第六章-在線瀏覽
2024-09-14 14:24本頁面
【正文】 以存活下來的所有細胞 ， 都應(yīng)該帶上了 pBR322質(zhì)粒分子 。 把這種富集了的培養(yǎng)物作適當(dāng)?shù)南♂尯?，轉(zhuǎn)接到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長 ， 于是在其pBR322質(zhì)粒分子的 Tetr基因序列中帶有 DNA插入片段的所有細胞 ， 都將停止生長 （ 注意：四環(huán)素不會使細胞死亡 ， 只是抑制細胞的生長 ） 。 此外 ， 在 pBR322質(zhì)粒的 Ampr基因序列中 ，也有一個 Pst I限制酶的唯一識別位點 。 但當(dāng) pBR322質(zhì)粒的 Ampr基因插入失活后 ， AmprTets菌落在碘 青霉素指示液中不褪色 ， 仍呈碘的藍灰色 。 這種方法的優(yōu)點是無需把每一個轉(zhuǎn)化子接種在 Amp和 Tet平板上 ， 直接在轉(zhuǎn)化平板上即可鑒定 。 目前使用紙片法使這一方法得到了改善：預(yù)先將一定大小的紙片浸泡在指示液中 ， 干燥后密閉保存 ， 使用時只要將紙片覆蓋在轉(zhuǎn)化平板上 ， 數(shù)分鐘內(nèi)就可以觀察到結(jié)果 。 當(dāng) pUC質(zhì)粒載體的 lacZ ?序列插入了外源DNA片段時 ， 會阻斷讀碼結(jié)構(gòu) ， 使其編碼的 ?肽失去活性 ， 結(jié)果產(chǎn)生出白色的菌落 。 利用插入序列提供的表型特征選擇重組體分子 這種選擇法要求所克隆的 DNA片段是一個完整的序列 ， 而且能夠在大腸桿菌中實現(xiàn)功能的表達 。 例如小鼠的二氫葉酸還原酶 （ DHFR）的分離： 先將含有 DHFRmRNA的小鼠總 mRNA制劑反轉(zhuǎn)錄成 cDNA拷貝 ， 構(gòu)建 cDNA基因文庫 。 這樣分離出來的抗性克隆 ， 顯然都是由于具有小鼠 DHFR基因的克隆片段 ， 賦予寄主細胞新的抗性表型所致 。 經(jīng)體外包裝 ， 轉(zhuǎn)導(dǎo)后能否形成清晰噬菌斑 ，尤其是對替換型 ?載體 ， 本身就是一種可利用的選擇標(biāo)記 。 利用核酸雜交篩選 從基因文庫中篩選帶有目的基因插入序列的克隆 ， 最廣泛使用的一種方法是核酸分子雜交技術(shù) 。 核酸雜交篩選法的最大優(yōu)點是它可以普遍廣泛地應(yīng)用 ， 尤其適合于大量群體的篩選 ， 只要有現(xiàn)成可用的特異性探針 ， 就可以有效地檢測任何一種插入的外源 DNA序列 ， 而不以這種序列能否在大腸桿菌中實現(xiàn)基因表達為前提 。 因為變性 DNA同硝酸纖維素濾膜有很強的親和力 ，便在膜上形成 DNA的印跡 ， 在 80℃ 下烘烤濾膜 ， 使 DNA牢固地固定下來 。 根據(jù)曝光點的位置 ， 便可以從保留的母板上相應(yīng)位置挑出所需要的陽性菌落或噬菌斑 ，這就是所需要的含有目的基因插入片段的重組體克隆 。 具有一定已知序列的核酸片段 ， 大小通常為 20kb左右 ， 再帶上一定的探測標(biāo)記 ， 就構(gòu)成了核酸探針 。 1. 放射性探針 廣泛使用的探針
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