【正文】 的胚液等量混合，按稀釋度分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至120小時，取出所有活胚,逐個收獲雞胚液，分別測定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)≥1:160 (微量法1:128)者判為感染，計(jì)算EID50，≥108EID50。 毒種繼代 應(yīng)不超過3代。3 制苗用毒液的制備 接種 取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋（如104或105），接種后密封針孔，置36～ 37℃繼續(xù)孵育，不必翻蛋。此后，每4～6小時照蛋1次，死亡的雞胚隨時取出，直至96小時，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2～8℃冷卻4～24小時。對每個雞胚在吸取胚液前均應(yīng)注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。同時作無菌檢查，應(yīng)無細(xì)菌生長。 雞胚胎兒收獲及浸出液的制備 在收獲及胚液的同時，取病變胎兒，去頭、腳，用生理鹽水洗2～3次，磨碎，制成（1：5）～（1：10）乳劑，加適宜的抗生素適量，然后離心或以4層紗布一層銅紗網(wǎng)濾過，置自然沉淀1～2日，然后取樣作無菌檢查。4 滅活 將上述無菌胚液以4層紗布及一層細(xì)銅紗網(wǎng)濾過，混合于一個大玻璃瓶內(nèi)，吸出數(shù)毫升樣品備測毒價(jià)。加甲醛溶液后最好傾倒另一瓶中，以避免瓶口附近黏附的病毒未能接觸滅活劑。期間振搖3～4次。5 半成品檢驗(yàn) 無菌檢驗(yàn) 取滅活的胚液及雞胚浸出液分別按附錄448進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。對所有胚液分別測定血凝價(jià)，應(yīng)不出現(xiàn)血凝，認(rèn)為滅活完全。雞胚浸出液也按照上述方法檢查。6 單相油乳劑滅活疫苗制備 油相制備 取注射用白油94份，加司本80 6份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。 乳化 取油相3份放于乳化罐內(nèi)，開動電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相1份，加完后再以10000r/min攪拌2～5分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，%。7 雙相油乳劑疫苗制備 用乳化罐乳化 水相、油相制備同單相苗，但水相制備中，雞胚液是按4%加入吐溫，而雞胚浸出液則按6%加吐溫。 取雞胚浸出液（單相苗雞胚液等量）放于乳化罐，開動電機(jī)緩緩加入上述油包水單相苗，加完后再以10000r/min攪拌2～5分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，.%。 用乳化罐乳化。9 成品檢驗(yàn) 物理性狀 外觀 為乳白色乳劑。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀不擴(kuò)散。 穩(wěn)定性 在37℃左右條件下放置21日，應(yīng)不破乳。單相苗在8秒以內(nèi)，雙相苗在5秒以內(nèi)為合格。 安全檢驗(yàn) 用30～60日齡健康易感雞（HI抗體≤1：4）6只，各肌肉或頸部皮下注射疫苗1ml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。 甲醛含量測定 按《甲醛含量測定法》進(jìn)行，應(yīng)符合《制品檢驗(yàn)的有關(guān)規(guī)定》。2 材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求 儀器及設(shè)備電子分析天平（，稱量范圍0～110g），費(fèi)休水份滴定儀(梅特勒DL31)。 檢驗(yàn)器具 止血鉗（開啟苗瓶），玻璃棒（或能搗碎檢品的器具），10ul注射器，燒杯。 其它 檢驗(yàn)記錄紙、筆、紗布和汗布手套。 按滴定儀的RUN鍵滴定儀自動滴定至終點(diǎn)。l注射器抽取10181。 按F1自動輸入樣品量； 按F2顯示樣品重量； 按F3確認(rèn)樣品重量； 滴定至終點(diǎn)自動打印出結(jié)果，打印結(jié)束按F3返回到待機(jī)模式； 重復(fù)標(biāo)定只需依上述第1條開始同法操作。 天平去皮后通過進(jìn)樣口將已稱重的樣品加入滴定杯中，將載樣杯放回天平。4記錄與計(jì)算5結(jié)果判定 ％，如有超過時，可重檢一次。它的基本原理是利用本儀器振動形成火花束，激勵諧振蕩回路，使次線線圈感應(yīng)出高頻高壓脈沖電壓，使被檢物產(chǎn)生不同顏色的輝光，根據(jù)顏色的變化來判斷疫苗的真空度。 檢驗(yàn)要在光線較暗的操作室里進(jìn)行，便于結(jié)果判定的準(zhǔn)確性。3 材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求 儀器及設(shè)備電火花真空檢測器。 檢驗(yàn)記錄紙、筆。 將真空檢測器尾部電源插頭插入220V電源插座里。 觀察并記錄逐瓶樣品的真空狀態(tài)。 測定樣品真空時，檢測器必須緩慢移動，放電簧不應(yīng)在一點(diǎn)停留時間過長，以免把玻璃擊穿，影響樣品本身的效果。6 結(jié)果判定如果容器內(nèi)出現(xiàn)白色、粉色或紫色輝光，則真空度檢查合格。滅活疫苗不得含有活的本菌或本毒。2 注意事項(xiàng) 抽樣后逐瓶檢查包裝、膠塞、瓶簽有無破損和毀壞，瓶內(nèi)有無雜質(zhì)。 各類生物制品的檢驗(yàn)操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。 保持實(shí)驗(yàn)室的清潔衛(wèi)生，嚴(yán)格遵守常規(guī)的消毒制度。 檢驗(yàn)用培養(yǎng)基 無菌檢驗(yàn) 厭氧性及需氧性細(xì)菌的檢驗(yàn) 用含硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（）和酪胨瓊脂培養(yǎng)基()。 純粹檢驗(yàn) 用適宜本菌生長的培養(yǎng)基。 制造疫苗用的各種原菌液、毒液和其它配苗組織乳劑、穩(wěn)定劑及半成品的無菌或純粹檢驗(yàn)，應(yīng)每瓶（罐）分別抽樣進(jìn)行，抽樣量為2～10ml。 檢驗(yàn)用培養(yǎng)基 無菌檢驗(yàn) 厭氧性及需氧性細(xì)菌的檢驗(yàn) 用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（）及酪胨瓊脂（）。 活菌純粹檢驗(yàn) 用適于本菌生長的培養(yǎng)基。 雜菌計(jì)數(shù) 。 檢驗(yàn)方法及結(jié)果判定 細(xì)菌原菌液及活菌苗半成品的純粹檢驗(yàn) ，1支置37℃培養(yǎng)；1支置25℃培養(yǎng)，觀察3～5日，應(yīng)純粹。 滅活檢驗(yàn) 細(xì)菌滅活后，用適于本菌生長的培養(yǎng)基2支，置37℃培養(yǎng)5日，應(yīng)無菌生長。 含甲醛、苯酚、汞類等防腐劑和抗生素的制品 ，接種樣品（凍干制品先做10倍稀釋）1ml，置37℃培養(yǎng)，3日后自小瓶中吸取培養(yǎng)物。 　　如制品允許含一定數(shù)量非病原菌，應(yīng)進(jìn)一步作雜菌計(jì)數(shù)和病原性鑒定。細(xì)菌性活疫苗應(yīng)純粹，其他制品應(yīng)無菌生長。如加防腐劑或抗生素。 每批抽檢的樣品必須全部無菌或純粹生長。如仍有雜菌，可抽取加倍數(shù)量的樣品重檢，個別瓶仍有雜菌，則作為污染雜菌處理。 檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩。 檢驗(yàn)完畢后開封的檢品均要經(jīng)過高壓滅菌處理。2 注意事項(xiàng) 為防止交叉污染，一個樣品用一個吸管或一個注射器。 檢驗(yàn)過程要仔細(xì)、認(rèn)真。 培養(yǎng)基 （含4%%裂解血球全血）馬丁瓊脂或酪胨瓊脂培養(yǎng)基（）。用普通肉湯或蛋白胨水50倍稀釋，接種于含4%%裂解血球全血的馬丁瓊脂平板或酪胨瓊脂（）平板上，每個樣品接種2付平板，放置36～38℃培養(yǎng)48小時，再放置室溫24小時，然后分別計(jì)算雜菌菌落（CFU）。 檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩。 檢驗(yàn)完畢后開封的檢品均要經(jīng)過高壓滅菌處理。如污染霉菌，亦作為雜菌計(jì)算。1 技術(shù)依據(jù)及原理病毒性活疫苗不得含有支原體。 對每批支原體檢驗(yàn)用培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量檢測，并作記錄。 操作人員必須戴口罩、工作帽，穿工作服，禁止檢驗(yàn)人員將頭發(fā)留在帽外。 必須在無菌、無支原體污染的環(huán)境條件下操作。 培養(yǎng)基檢測由禽胚組織或其細(xì)胞制成的活疫苗用改良Frey氏培養(yǎng)基。4 檢驗(yàn)步驟 樣品處理每批制品取樣3～5瓶，混合后備用。 接種與觀察 液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 取5ml疫苗混合物接種于盛20ml小瓶液體培養(yǎng)基中，將小瓶與小管放36～38℃培養(yǎng)，每日觀察培養(yǎng)物有無顏色變黃或變紅。若仍無變化，在最后一次接種小管的培養(yǎng)物經(jīng)14天觀察后停止觀察。應(yīng)立即移植于小管液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，觀察在液體培養(yǎng)基中是否出現(xiàn)恒定的pH變化，及在固體上有無典型的“煎蛋”狀支原體菌落。此外，在液體培養(yǎng)基顏色出現(xiàn)變化，pH值變化達(dá) 177。各瓊脂平板每5～7天在低倍顯微鏡下觀察檢查有無支原體菌落出現(xiàn)，經(jīng)14天觀察，仍無菌落者停止觀察。禽類疫苗用滑液支原體作對照，非禽類疫苗用豬鼻支原體作對照。檢驗(yàn)完畢后開封的產(chǎn)品均要經(jīng)過高壓滅菌處理。 滴撒在操作臺、地面的異物和污染的工作服要進(jìn)行消毒處理。6 記錄和計(jì)算檢品在接種相關(guān)培養(yǎng)基后，每天培養(yǎng)情況并記錄觀察結(jié)果。 陽性對照中至少有一個平板長菌落，而陰性對照中無菌落生長，則檢驗(yàn)有效。小管與小瓶皆須用膠塞或螺旋塑料塞封口。因此用高效價(jià)單特異抗血清中和待檢物中相應(yīng)活性成分或經(jīng)適當(dāng)處理后，接種不同的培養(yǎng)基質(zhì)，觀察病變以檢出污染的外源病毒。 中和用抗血清應(yīng)高效價(jià)、單特異性。3 材料、儀器、試劑的準(zhǔn)備及基本要求 儀器及設(shè)備孵化器，CO2 培養(yǎng)箱，普通冰箱，普通顯微鏡，熒光顯微鏡，水浴鍋，照蛋箱。除另有規(guī)定者外，病毒中和劑量為10羽份。 檢驗(yàn)方法 禽源細(xì)胞、種毒及其制品用雞胚接種檢查法 尿囊腔內(nèi)接種試驗(yàn) 試驗(yàn)法 選擇發(fā)育良好的9～11日齡SPF雞胚10枚，(如為疫苗，至少含10個羽份)，在37℃培養(yǎng)7天，棄去在接種后24小時內(nèi)死亡的雞胚，但雞胚至少成活8/10，試驗(yàn)方可成立。 判定 雞胚發(fā)育正常，尿囊液紅細(xì)胞凝集陰性，該批制品判合格。培養(yǎng)結(jié)束時打開雞胚，觀察雞胚及CAM有無異常，取尿囊液做紅胞凝集試驗(yàn)，室溫靜置15～30分鐘，觀察有無紅細(xì)胞凝集。5 安全措施檢驗(yàn)過程中注意防止人員和環(huán)境的污染，檢驗(yàn)人員必須穿戴工作服和口罩，嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作并在相應(yīng)安全等級（級別）的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，以防散毒。7鑒別檢驗(yàn)1 技術(shù)依據(jù)及原理將含有對病毒外殼或囊膜抗原的特異抗體的血清與相應(yīng)疫苗病毒混合，可使兩者結(jié)合（即中和），使病毒失去對其宿主的感染性。2 試驗(yàn)過程的注意事項(xiàng) 應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。 試驗(yàn)前應(yīng)知道疫苗病毒的含量或毒價(jià)，否則，須先行測定。 細(xì)胞瓶上要有標(biāo)記，防止錯將細(xì)胞面放反。 試驗(yàn)完畢要及時清理現(xiàn)場，做好消毒處理工作。 試劑特異性血清，疫苗稀釋液（生理鹽水、細(xì)胞培養(yǎng)液或適于病毒和宿主動物的其他稀釋液），無機(jī)鹽類，細(xì)胞培養(yǎng)液（MEM、19乳漢液、乳歐液），健康牛血清，抗生素（青、鏈霉素）， ％胰酶，細(xì)胞分散液EDTA，酚紅（1％），消毒劑（酒精、碘酊及脫脂棉球等）。 其他 檢驗(yàn)記錄紙、筆等3 檢驗(yàn)步驟 逐瓶核對疫苗及其特異性血清瓶簽，分別排放于操作臺上。 稀釋血清 對產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定需要稀釋的特異性血清（馬立克氏病特異性血清和傳染性法氏囊病特異性血清），用滅菌生理鹽水作倍比稀釋至該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的稀釋度。 按其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的接種量，分別計(jì)算疫苗及其特異性血清的中和用量。 取適宜吸管，定量