【正文】 ）創(chuàng)制15個以上的高產(chǎn)、優(yōu)質、強健新型遺傳素材，培育2個標志性新蠶品種。三、研究方案1．學術思路 利用家蠶全基因組序列和高精度遺傳變異圖譜，通過家蠶基因定位克隆、基因敲除和敲入，轉基因及RNA干擾等現(xiàn)代分子生物學技術，以家蠶絲蛋白合成、變態(tài)發(fā)育激素調(diào)節(jié)、組織器官形成的干細胞基礎以及分子免疫為目標，系統(tǒng)深入研究關鍵基因的調(diào)控方式和信號傳導，解析關鍵品質性狀的分子機理；利用GAL4/UAS系統(tǒng)在特定組織特定時間解析特定基因的功能和調(diào)控；利用鋅指核酸酶等技術實現(xiàn)家蠶基因組的定向編輯，研究建立家蠶分子育種理論和技術；通過對關鍵分子靶標的遺傳操作實現(xiàn)品質性狀的分子改造、素材創(chuàng)新和品種育成，奠定產(chǎn)業(yè)實際應用的基礎。 2．技術途徑 項目總體采用三條主要技術路線：一是精細圖譜—變異圖譜—基因定位，二是基因功能—調(diào)控機理—性狀形成，三是關鍵基因—素材創(chuàng)新—產(chǎn)業(yè)應用。 （2）基因功能—調(diào)控機理—性狀形成 針對不同基因，設計不同技術路線研究基因調(diào)控機理：絲蛋白編碼基因主要通過生物信息分析篩選候選順式作用元件，利用DNA—蛋白質結合技術鑒定順式作用元件和轉錄調(diào)控因子，進而探索轉錄調(diào)控與激素信號等通路之間的聯(lián)系；激素與發(fā)育相關基因將主要通過轉基因和RNAi等技術，對目標基因進行功能研究和調(diào)控分析，以及通過組織和細胞分離與離體轉化和培養(yǎng)技術對基因表達調(diào)節(jié)和功能在分子、細胞、器官和個體水平上進行研究；干細胞發(fā)育分化相關基因主要通過熒光示蹤鑒定特定組織的干細胞和尋找干細胞發(fā)育和分化的關鍵節(jié)點，結合基因芯片、基因誘捕、生物信息學等技術手段，建立成蟲組織干細胞的分化調(diào)控網(wǎng)絡；免疫相關基因主要通過Pulldown等鑒定與病原物結合的蛋白，通過基因在細胞或者個體表達調(diào)控研究對下游信號通路、抗菌效應因子和病原誘導存活率的影響。 總體技術路線如下：3．創(chuàng)新點與特色 （1）重要品質性狀關鍵基因作用機理及其調(diào)控網(wǎng)絡的系統(tǒng)性解析 重點抓住蠶產(chǎn)量和品質關鍵，通過絲編碼基因調(diào)控機理、變態(tài)發(fā)育激素調(diào)控、成蟲組織干細胞發(fā)育分化和免疫與抗性四個密切相關的課題，系統(tǒng)并深入解析家蠶重要品質形成的關鍵基因和調(diào)控網(wǎng)絡。 （2）突破分子育種理論和技術關鍵 其它昆蟲（主要是害蟲）的基礎研究主要以控制和防治為目的，而本項目的主要目標集中于有效利用，具有特殊性。與蠶絲產(chǎn)業(yè)技術傳統(tǒng)研究相比，具有理論上的先進性、技術方法的現(xiàn)代性和研究方案的高效性，將突破傳統(tǒng)育種無法逾越的障礙，推動蠶絲業(yè)技術革命并奠定長遠可持續(xù)發(fā)展基礎。另一方面，與小鼠、線蟲、果蠅、斑馬魚、擬南芥等其它模式生物相比，現(xiàn)代昆蟲學研究還缺乏一種重要的模式昆蟲，其主要障礙之一是缺乏有效的、專一的、定向的和可控的基因敲除與敲進等遺傳操控技術體系。4．可行性分析項目承擔單位近年來共完成家蠶相關研究項目70余項，包括1項“973”項目、10項“863”項目、15項“九五”重大科技攻關項目、4項國家自然科學基金重點項目和40余個面上項目，完成了項目的基礎積累。五”期間認真執(zhí)行“973”家蠶項目，至少在三個方面奠定了本項目的重要基礎：一是集中了全國優(yōu)勢力量，形成緊密的分工協(xié)作研究框架，通過引進和培養(yǎng)形成了一支強有力的研究隊伍；二是各個承擔單位建設了高水平的研究平臺，并形成了各自的特色和優(yōu)勢；三是完成了前一期項目各項研究任務，建立了較為完善的平臺技術，關鍵性狀研究取得了突破。 在工作保障方面，先后召開了多次全國性家蠶基礎研究討論會，統(tǒng)一了學術認識和研究思路，確立了有機的整體方案，形成了有效的協(xié)作機制。通過國際學術交流和國際合作項目，與世界高水平研究機構建立了穩(wěn)定的合作關系，為本項目的開展提供了良好的國際合作空間。我們相信，通過立項，集成優(yōu)勢，緊密合作，完全可以在家蠶基礎研究上做出更大更出色的標志性成果，為絲綢之路增添異彩，為中華民族產(chǎn)業(yè)的發(fā)展做出歷史性貢獻。該課題為項目的核心。在長期自然和人為選擇過程中，積累了大量的家蠶突變品系，有關突變基因遺傳研究基礎相當扎實。其中，與蠶絲產(chǎn)量相關的有5個，包括薄紙繭（flc，（下同），后部絲腺分泌能力低下）、裸蛹（Nd，不分泌絲素）、絲膠繭（Nds，絲素輕鏈不能合成）和裸蛹b（Ndb，遺傳座位未知，絲腺退化）等；與蠶絲品質相關的有5個，綿繭（Fl，繭層浮松）和軟繭（Sc，遺傳座位未知，繭層柔軟似綿）等；與蠶繭顏色相關的有12個，包括黃色、綠色、銹色等系列；與蠶營繭行為相關的有4個，包括破風繭和吐平板絲等。如能分離克隆這些突變基因，極有可能為家蠶絲蛋白合成研究和分子機制研究打開突破口。這兩個突變具有重要的研究價值：首先，這兩個突變基因座位都與具體的編碼基因相去甚遠，因此不可能是編碼基因突變；其次，從候選基因的情況看，推測與激素和絲腺細胞發(fā)育信號相關。 （2）家蠶絲腺發(fā)育調(diào)控與絲蛋白編碼基因表達的空間特異性 家蠶絲腺是起源于外胚層的器官，發(fā)生在胚子最長期和反轉期。幼蟲期，絲腺細胞不再發(fā)生分裂，至5齡后期，一個絲腺細胞核內(nèi)DNA的復制次數(shù)達到29～30次，細胞核內(nèi)的DNA量增加至107μg和214μg，分別相當于原來的54萬倍或108萬倍。絲腺細胞分化不但形成了功能特異的前、中和后部三個部分，而且決定了絲蛋白編碼基因表達的空間特異性。絲蛋白編碼基因存在著一些關鍵的順式作用元件，我們將重點研究絲蛋白編碼基因順勢作用元件PaxPaxFOX類的轉錄因子結合位點的功能。 （3）家蠶絲腺發(fā)育調(diào)控與絲蛋白編碼基因轉錄的時期特異性形成機理 家蠶在孵化之后，就具有合成少量絲蛋白的能力。當幼蟲發(fā)育到末齡第3天，絲腺開始大量合成絲蛋白，直至幼蟲期結束，絲蛋白充滿整個絲腺腔體，以后則進入吐絲營繭期，表明家蠶絲蛋白合成具有嚴格的時期特異性。 目前為止，已發(fā)現(xiàn)了幾個絲腺特異因子，如SGF1和SGF3，它們參與了絲膠基因及絲素基因的轉錄調(diào)控。前期項目在絲蛋白編碼基因上游鑒定了兩個與轉錄因子BRC Z4和BRC Z1結合的重要位點。研究還發(fā)現(xiàn)，BRC的表達時期與絲蛋白的表達時期是相反的，很可能與絲蛋白基因的上游結合位點序列結合，抑制絲素基因在眠期的表達。 （4）家蠶絲產(chǎn)量和絲品質形成機理一般認為，家蠶產(chǎn)絲能力受多個基因調(diào)控并具有伴性遺傳特征，而部分繭絲品質具有較高的遺傳力。家蠶的產(chǎn)絲性狀主要包括繭重、繭層量和繭層率等指標，是長期以來育種工作的主要選擇對象，雖然有不少提高但機制形成不明。然后利用近19萬個SNP位點，對該材料進行了全面掃描，初步獲得了全繭重、繭層量和絲長等性狀顯著密切相關的QTL位點，而繭層率也具有潛在的QTL位點。 其次是解析蠶絲主要成分蛋白的晶體結構。日本提出了這三種蛋白的初步構象關系（絲蛋白小體結構模式），但缺乏結構生物學證據(jù)。前期項目我們克隆了絲素重鏈N段序列，并獲得了其編碼蛋白的高分辨率晶體結構，首次發(fā)現(xiàn)了其立體結構以β片層為主，并初步提出了絲纖維空間構象。以結構生物學為指導，還將探索改變蠶絲蛋白編碼基因或者蛋白質組分，以改進蠶絲工藝缺陷，開發(fā)新功能的可能途經(jīng)。前期項目中，通過構建不同家蠶品系和野蠶全基因組高精度遺傳變異圖譜，共計鑒定了354個與產(chǎn)絲性狀相關的蛋白質編碼基因作為馴化的候選基因。在絲腺表達基因中，絲腺特異因子1（Sgf1）是與果蠅Fkh同源的一個基因，Sgf1調(diào)控家蠶絲膠1基因編碼的絲膠蛋白和三個分別編碼絲素重鏈、輕鏈和fhx/P25絲素基因的轉錄。它在高絲量品種中的含量是常規(guī)品系“大造”的4倍。本期項目將重點探討這些候選基因在蠶絲產(chǎn)量和品質形成中的重要作用，綜合上述各方面的研究成果，探索家蠶較之野蠶產(chǎn)絲能力和絲品質差異的主要分子機制。定位克隆至少9個與絲腺突變相關基因，完成包括這些基因在內(nèi)的9個與絲產(chǎn)量和絲品質密切相關的調(diào)控基因的功能研究，解析突變性狀產(chǎn)生的分子機理，揭示家蠶絲蛋白合成調(diào)控中的信號通路及其與蠶絲產(chǎn)量和品質形成的關系。包括家蠶絲蛋白合成空間特異性和時期特異性的分子機制，以及不同絲纖維蛋白組分協(xié)同調(diào)控性對產(chǎn)絲量的影響；獲取5個左右的關鍵順式作用元件，并探索通過轉錄因子或順式作用元件的改造，提高絲產(chǎn)量或改變蠶絲組分。對主要產(chǎn)量性狀主效QTL進行精細定位，克隆獲得主要基因或者調(diào)控區(qū)域，探明這些基因或調(diào)控序列對家蠶產(chǎn)絲量的影響和作用機制；解析絲素重鏈H、絲素輕鏈L和P25的晶體結構，探明絲蛋白空間結構與物理、化學特性以及與蠶絲加工工藝性狀之間的關系；分析與產(chǎn)絲性狀相關的蛋白質編碼基因在蠶絲產(chǎn)量和品質形成中的重要作用，探明家蠶較之野蠶產(chǎn)絲能力和絲品質差異的主要分子機制。 （4）取得基因專利6項；出版專著1部，在國內(nèi)外核心刊物發(fā)表論文55篇，其中有重要影響的論文10篇以上，發(fā)表1篇有重要理論突破的高水平研究論文。經(jīng)費比例： % 承擔單位： 浙江大學、西南大學、安徽農(nóng)業(yè)大學、中國科學技術大學 課題負責人： 鐘伯雄 學術骨干： 繆云根、劉春、孟艷、李衛(wèi)芳課題2：家蠶激素和營養(yǎng)信號傳導與變態(tài)發(fā)育調(diào)控研究研究目的：重點研究家蠶變態(tài)發(fā)育的昆蟲激素信號轉導主要途徑和關鍵調(diào)控分子的作用，揭示激素調(diào)控與營養(yǎng)代謝及其與器官退化和再生的關系，比較完整地建立關于家蠶變態(tài)發(fā)育的理論體系和機理模型以解釋昆蟲變態(tài)發(fā)育這個重大的科學問題，促進通過控制變態(tài)發(fā)育以提高家蠶蠶絲產(chǎn)量和質量的技術和策略的發(fā)展及應用，并為以變態(tài)發(fā)育相關基因和蛋白為分子靶點進行鱗翅目害蟲的生物防治和研制新型殺蟲劑的發(fā)展策略提供理論依據(jù)與技術指導?？傮w而言，蛻皮激素控制著昆蟲的蛻皮與變態(tài)發(fā)育進程，而保幼激素控制著昆蟲發(fā)育的方向。前期項目已經(jīng)完成了家蠶變態(tài)發(fā)育期基因表達譜的全基因組芯片分析，并著重分析了家蠶20E和JH合成代謝途徑相關的基因，以及20E和JH信號傳導途徑相關基因的功能。 本期項目將以家蠶絲腺、脂肪體、中腸和表皮為主要研究材料，闡明20E和JH的信號傳導途徑及其分子互作，這兩種激素如何協(xié)同決定家蠶的變態(tài)發(fā)育。發(fā)現(xiàn)MET與20E受體形成超級受體復合體，探究MET與EcRUSP的蛋白質蛋白質相互作用，闡釋MET如何參與JH和20E信號、如何橋接JH和20E信號傳導的分子互作；6）JH和20E信號傳導途徑中關鍵轉錄因子基因對家蠶絲腺發(fā)育和蠶絲產(chǎn)量的調(diào)控；7）研究調(diào)控蛹期專一表達的表皮蛋白基因的調(diào)控，如JH和20E兩個激素信號系統(tǒng)對蛹期專一轉錄因子BRC和其上游調(diào)控基因met、gce和Krh1等的調(diào)控；研究BRC轉錄因子對其下游轉錄因子POUM2和bFTZF1的調(diào)控作用的分子機理；分離和鑒定與轉錄因子POUM2結合的核蛋白，研究其在表皮蛋白基因專一表達調(diào)控中的作用。蛻皮激素和保幼激素協(xié)同調(diào)控昆蟲變態(tài)發(fā)育，并決定昆蟲生長持續(xù)時間。這些激素和營養(yǎng)信號相互作用，最終共同決定個體大小。這樣，在激素和營養(yǎng)兩方面的共同作用下，影響了家蠶個體大小及產(chǎn)絲量。類胰島素信號傳導途徑中InR和IRS等大多數(shù)基因的表達水平在蛻皮和化蛹等非攝食時期顯著上升。另外，在蛻皮和化蛹時期，20E和饑餓抑制類胰島素信號（Akt磷酸化水平）和TOR活性（4EBP和S6K磷酸化水平），導致轉錄因子FOXO定位在細胞核內(nèi)，并誘導InR、IRS和Brummer的表達。主要內(nèi)容包括：1）FOXO對InR和Brummer的轉錄調(diào)控；2）20E和JH與PI3KTOR信號之間的分子互作，以及PI3KTOR信號對家蠶變態(tài)發(fā)育和蠶絲產(chǎn)量的分子調(diào)控；3）激素和營養(yǎng)信號對脂肪體PCD的調(diào)控；4）轉基因和基因敲除營養(yǎng)途徑中關鍵因子以改變家蠶的變態(tài)發(fā)育和提高蠶絲的產(chǎn)量和質量，并闡明其分子機理。 （3）家蠶變態(tài)發(fā)育中幼蟲組織退化與成蟲器官形成的激素調(diào)控機制變態(tài)時舊器官（如幼蟲器官）消亡和新器官（如成蟲器官）生成都是在昆蟲激素的調(diào)控下發(fā)生和完成的。對于舊器官的消亡，目前認為主要通過PCD如細胞凋亡和細胞自噬作用得以實現(xiàn)。在變態(tài)時，蛻皮激素信號解除JH抑制作用，誘導干細胞的分裂分化最終導致新器官的形成（如成蟲的翅膀）。發(fā)現(xiàn)在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中，20E對脂肪體器官重建起了至關重要的調(diào)控作用，而JH則拮抗20E信號。20E信號還可增大脂肪體細胞膜通透性而誘導PCD，初步認為這是20E誘導表達的組織蛋白酶cathepsin所致。此外，20E還參與調(diào)控成蟲盤細胞的分裂與分化。20E首先啟動了BRC Z4的表達，后者再激活轉錄因子POUM2的表達，然后POUM2結合到BmWCP4的啟動子調(diào)控元件上，啟動了BmWCP4基因的表達，從而導致蛹期和表皮專一的翅原基表皮蛋白BmWCP4的表達，使翅原基發(fā)育成翅膀，幼蟲實現(xiàn)向蛹和蛾的變態(tài)發(fā)育。 本期項目將重點研究家蠶絲腺、脂肪體、中腸和表皮等重要器官在蛻皮和變態(tài)發(fā)育過程中的退化和重建過程（包括細胞程序性死亡，如細胞凋亡和細胞自噬等，以及細胞再生和分化過程）及昆蟲激素對這些過程的分子調(diào)控作用。主要內(nèi)容包括：1）20E和JH對絲腺、脂肪體、中腸和表皮在變態(tài)期前后細胞自噬和凋亡關鍵基因（BmAtgBmAtgBmAtgBmAtgBmAtgBmAtgBmAtg1BmE74A和Bmcaspase、IAP）的表達變化及定位，探討20E和JH信號傳導途徑中關鍵基因的應答與制約關系；2）研究激素信號和饑餓信號引發(fā)家蠶中腸、絲腺和脂肪體組織發(fā)生自噬和凋亡的基本特征，并揭示激素信號和饑餓信號途徑的關系；3）通過RNAi、轉基因過量表達與在活體和離體細胞knock out或knock down等方法，解析20E和JH信號傳導途徑中關鍵靶基因在控制家蠶器官退化時細胞自噬和凋亡的調(diào)控功能；探討細胞自噬和細胞凋亡途徑的激素調(diào)控相互關系；4）以昆蟲激素調(diào)控家蠶翅原基表皮蛋白基因的蛹期專一表達為研究對象，深入研究20E和JH信號傳導途徑對翅原基在蛹變態(tài)發(fā)育時再生長與分化的調(diào)控分子機理，建立較完整的昆蟲激素調(diào)控變態(tài)發(fā)育的理論模型；5）解析家蠶早期胚胎發(fā)育中控制成蟲分節(jié)發(fā)育的關鍵基因對激素的應答關系和在中腸、脂肪體和成蟲盤中促進細胞再生的功能。定位克隆10個以上的化性、眠性等重要突變基因，深入研究至少10個基因的功能與調(diào)控，獲取6個左右的關鍵順式作用元件，促進通過控制家蠶變態(tài)發(fā)育以提高家蠶絲產(chǎn)量和質量的技術策略的發(fā)展和應用，并為以變態(tài)發(fā)育相關基因和蛋白為分子靶點進行鱗翅目害蟲的生物防治和研制新型殺蟲劑的發(fā)展策略提供理論與技術支持。以家蠶的絲腺、脂肪體、中腸和表皮